Diseño de cebadores con sitios de restricción

Quiero diseñar un cebador directo e inverso que incluya voladizos con sitios de restricción, con el ADN utilizado para la clonación de enzimas de restricción.

Si quiero enviar mi ADN a una empresa de síntesis, ¿debo incluir el anexo adjunto con los sitios de restricción al ADN? ¿Importa si los cebadores tienen el saliente del ADN dentro de su secuencia?

De la secuencia justo al final, ¿qué secuencia de pb se recomendaría para mis cebadores si quiero aprox. 20-25bp para la imprimación?

Vea a continuación la secuencia de cDNA:

Nde1 sitio de corte: 5' ... CA|TATG ... '3'

Sitio de corte Xho1 : 3'...GAGCT|C...5'

ADNc con salientes que tienen sitios de restricción, Ndel1 (5'->3') y Xho1 (3'->5')

5' catatg - ATGGGTTCAAACACTTCCAAAGTGGGTGCTGGTGCAGAAAAACAACAAGTCTATACTCCG
CTAACACAGATCGATTTTTCACAGTCTTTGGTTTCTCAATTGGATTCATCGAAGGAATCA
GACTATGTCACCAAGCAAAATGCAGAAAAGTTCATTGAGAAGAAGGTTTCACAAAGGCTA
TCTAACCTAGAAGTTGAAACGTTAAAGAAGTTTGAAGATACTTTGAACAATTCACTATTA
TCAGACGACGACAAGGATGCCGTTGATGGAATATCATCAAGTTCATTGAATAATCAAATC
GAGTCGTTGAACAAGAAACTAACATTATTTGATCAATTAGAGTTACAAAAGTTGGAGAAA
TATGGGGGTGCCAAAGGTAAATCTGATAAAAAAACCGACAACGGCAGCATTTCTATAAAG
GCAAAATTGACTGAGTGTCTTTTGGCCAATAAGGGCAAGCCATTGAATTGTTACGAAGAG
ATGGAAGAATTCAAGAAGCTCGTTATGGGTTGA - gagctc 3'
Agregué una respuesta, pero no entiendo completamente lo que quiere decir cuando dice:> "De la secuencia justo al final, ¿qué secuencia de pb se recomendaría que use para mis cebadores si quiero aproximadamente 20-25 pb para la imprimación?" ¿Nos está preguntando qué secuencia debe usar para el cebador inverso?
Sí, solo quería tener una idea para la secuencia del cebador, o esencialmente si pudiera comenzar (es decir, incluyendo todo el voladizo) el cebador justo al comienzo del voladizo.
Su secuencia de cebado debe ser el complemento inverso de los últimos ~20 pb de la secuencia de codificación . Agregue el sitio de restricción en el extremo 5 'de esto, luego su voladizo después de eso. En general, su base será 20+6+3= 29 pb

Respuestas (1)

Sí.

Si tiene la intención de subclonar el fragmento a través de la clonación clásica de enzimas de restricción, necesita el voladizo.

Diferentes enzimas de restricción requieren diferentes longitudes de voladizo para permitirles asentarse completamente en la hebra y luego escindir la secuencia.

NEB tiene una gran página que detalla cuántas bases se necesitan para las enzimas que venden:

https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

No, no importa si el saliente aparece en otra parte del ADN, siempre y cuando sus sitios de restricción no lo hagan (obviamente).

Aquí hay algunas consideraciones que utilizo al diseñar cebadores para PCR (aunque no son del todo aplicables si solo lo está sintetizando):

  • Utilice los más de 3 pares de bases presentes en la cantidad dada de nucleótidos en su sitio de restricción en la secuencia desde la que está PCRing como su secuencia sobresaliente para permitir que se unan algunas bases más. Es decir

    Con la siguiente imprimación:

    Voladizo - Sitio de restricción - Secuencia de cebado

    AAA-GGATCC-ATGACATGCAGTAGC PRIMER

    ||| |||||||||||||||

    TTT--------TACTGTACGTCATCG TARGET SEQUENCE

  • Alternativamente, uso esos 3 o más pares de bases para agregar o eliminar contenido de GC y manipular la Tm si las temperaturas de recocido de los 2 cebadores no coinciden idealmente.

Gracias, tiene sentido, pero si las enzimas de restricción que estoy usando cortan los salientes, también dejarán algunos pares de bases aguas arriba y aguas abajo del gen real, ¿esto causará problemas de enmarcado o no importa dónde se inserta el GOI? en un plásmido MCS?
Para corregir el encuadre, debe / podría agregar bases entre el sitio de restricción y el fragmento de interés. Pero como su NdeI ATG está enmarcado con el start-ATG, no espero ningún problema. Incluso podría eliminar uno de esos ATG si lo desea.
Bien, ¿debería eliminar TATG de 5'... CA|TATG... '3' (Nde1) y C de 3'...GAGCT|C...5' (Xho1)? Si agrego bases, ¿eso solo creará extremos romos?
La única preocupación que tengo es el espacio que los pares de bases sobrantes crean aguas arriba, no estoy seguro de si esto afectará la traducción.
El exceso desaparecerá cuando digiera con las enzimas de restricción. la única secuencia que persistirá son los sitios de restricción que permiten una incorporación perfecta a su vector. Las bases adicionales de los sitios de restricción no se pueden traducir, ya que estarán antes de su codón de inicio y después del codón de terminación. Si esto no tiene sentido para usted, le sugiero que lea los conceptos básicos de la clonación en Sambrook et al u otro buen libro de texto.
Las bases marcarán la diferencia si desea clonar algo en marco con una etiqueta / proteína de fusión o algo así. También cambiar el espacio entre el RBS y el codón de inicio podría alterar un poco la expresión.
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