Diseño manual de cebadores para un gen en la hebra inversa

No es una pregunta estúpida en absoluto. Estaba tan confundido por esto como un principiante en biología molecular. Te acostumbras después de un tiempo. :)

Me resulta mucho más difícil diseñar cebadores a partir de una sola hebra, especialmente la hebra negativa, por lo que siempre intento que ambas funcionen. Si no tiene ganas de hacer eso, solo una hebra es suficiente (más o menos), pero recomendaría al menos obtener el complemento inverso en su caso porque las hebras positivas son mucho más fáciles de trabajar.

Para un ejemplo rápido, digamos que tengo una secuencia de diez pb para la que quiero diseñar cebadores y esta es mi secuencia positiva:

5' ATAACTTCGT 3'

Ahora digamos que quiero una cartilla de tres pb. Entonces, el cebador directo sería simplemente 5' ATA 3', eso es fácil. El cebador inverso, si lo tomo desde allí sin voltearlo, sería 5 'CGT 3'. Pero si pongo eso en mi reacción de PCR, no hará nada porque el ADN se une a su cadena complementaria, lo que significa que el cebador solo se uniría a 3' ACG 5' o 5' GCA 3'. Entonces, en cambio, voy a querer 3' ACG 5' porque se unirá a su complemento, la parte 5' CGT 3' de mi secuencia. (Problema técnico aquí, los proveedores generalmente solo dan la opción de escribir en 5' a 3', lo cual tiene sentido, pero debe recordar voltear su imprimación inversa antes de dárselo porque originalmente estará en 3' a 5'. En este caso, pediría 5' GCA 3'.)

Sin embargo, esto es más fácil de visualizar si tengo tanto el hilo positivo como el negativo, que se vería así:

5' ATAACTTCGT 3'
3' TATTGAAGCA 5'

Si tiene ambas hebras como en el ejemplo anterior, puede encontrar tanto la imprimación directa como la inversa sin mucha dificultad.

Podría dar una respuesta más completa de cómo funciona todo esto durante la replicación del ADN que incluiría ilustraciones, alegorías y tal vez algunos chistes levemente humorísticos, pero odiaría aburrirlos innecesariamente, así que avísenme si lo entienden ahora o si necesitas mas. ;)

Editar: ¡Exactamente (a tu tercer comentario me refiero)! Recuerde, el ADN siempre se lee y replica de 5' a 3', por lo que el cebador directo se unirá a la hebra negativa y se replicará de 5' a 3', por lo que extenderá la secuencia hacia la derecha. El cebador inverso es lo opuesto, de 3' a 5', por lo que extenderá el hilo positivo hacia la izquierda. Después de que sucedan ambos, terminarás con dos hilos completos. Como prometí, aquí hay una ilustración:

Ahora, a su pregunta sobre Primer-BLAST. No tiene que ingresar una hebra positiva, pero la herramienta asume que está ingresando la hebra positiva, por lo que obtendrá los cebadores correctos, solo los llamará con los nombres incorrectos (es decir, con el ejemplo anterior, le daría 5' GCA 3' como cebador directo y 5' ATA 3' como reverso). Los cebadores directo e inverso se tratan exactamente de la misma manera, por lo que esto no descartaría su PCR, pero de todos modos sería incorrecto. Para evitar confusiones, sugiero utilizar una herramienta para convertir su secuencia de menos en más antes de ejecutarla. Es bastante fácil obtener el complemento inverso de cualquier secuencia; Aquí hay una buena herramienta para eso.

Espero que esto ayude. :)