Estoy realizando una mutagénesis en un gen in vivo que necesito ligar en un vector de expresión. Los cebadores que he diseñado se superponen a los sitios de restricción que planeo usar para ligar en el vector de expresión. Las partes entre los cebadores intentaré crear mutantes con PCR propensa a errores.
Mi preocupación son los voladizos 3 'A que se crean a partir de la polimerasa Taq. ¿Qué tan frecuente es esto? Si es muy común, ¿cuál es la mejor manera de tener en cuenta estas adiciones al tratar de ligar mi producto de PCR en el vector?
No estoy seguro de un caso en el que Taq no agregue voladizos de 3 'A.
Puede usar la clonación TA para clonar su producto de PCR. El principio básico es utilizar un vector con voladizos en T de 3'. Si tiene un vector sin estos salientes, puede usar una transferasa terminal + dTTP para crearlos (o incluso Taq, pero esto no es tan bueno porque agrega un paso de purificación para aislar los vectores con salientes; la transferasa terminal es mucho más eficiente ). Luego puede ligar su producto de PCR que tiene un saliente de 3'.
Los protocolos para agregar los voladizos de 3' T a su vector se proporcionan en Zhou y Gomez-Sanchez 2000 .
Utilice pGemT para clonar su producto de PCR. Está diseñado exactamente para aceptar productos con voladizos de 3' y cuenta con una selección de azul/blanco, ¡así que es bastante fácil de hacer! Luego, cortaría pGem con los sitios de restricción que agregó durante su PCR y lo ligaría a su vector de expresión.
Kevin
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