¿Por qué se suministra EcoRI con un búfer único cuando supuestamente es 100 % activo en búferes universales?

Thermo empaqueta un búfer único con EcoRI:

  • Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)
  • MgCl2 10 mM
  • NaCl 100 mM
  • 0,02% Tritón X-100
  • 0,1 mg/mL de ASC

Sin embargo, también enumeran su enzima EcoRI como 100% activa en Buffer O sin actividad de estrella indicada:

  • Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 a 37 °C)
  • MgCl2 10 mM
  • NaCl 100 mM
  • 0,1 mg/ml de BSA

Lo mismo ocurre con 2X Tango:

  • Tris-acetato 66 mM (pH 7,9 a 37 °C)
  • Acetato de magnesio 20 mM
  • Acetato de potasio 132 mM
  • 0,2 mg/ml de ASC

¿Hay alguna razón por la que uno preferiría usar el búfer único sobre uno universal? Dado que la compatibilidad con tampones es un factor de venta importante para las enzimas de restricción, ¿por qué continuarían proporcionando un tampón único?

Espero la explicación de por qué esta es una pregunta de tarea...
Yo también. Creo que esta es una pregunta legítima. Y uno interesante, también.
Curiosamente, para el sistema Fast Digest se recomienda un tampón universal (verde).
@Chris Gracias. ¿Están diseñadas las enzimas Fast Digest? Sé que NEB ofrece dos enzimas EcoRI: regular y de alta fidelidad. Este último está diseñado para alta actividad en tampones universales. Para Thermo, su EcoRI "regular" aparentemente está activo en múltiples búferes universales y en realidad se suministra con el búfer único y Tango universal.
La composición de los tampones de digestión rápida no se revela... Encontré un artículo que relaciona la presencia de Triton X-100 con una actividad estelar más baja, pero usan una concentración mucho más alta, ver aquí .
Tengo la sospecha de que el búfer único podría ser técnicamente el mejor, pero la enzima también está casi completamente activa en los búferes universales y muestra una actividad estelar insignificante, por lo que simplemente lo enumeran como 100% activo por simplicidad. Puedo escribir a su soporte técnico un breve correo electrónico para ver si pueden aclararlo.
Si es así, por favor avísanos cuando recibas una respuesta que nos diga algo (aunque lo dudo).
@Chris lo haré.
Haría +1 en su pensamiento para preguntar a su soporte técnico; probablemente tengan más datos técnicos que la mayoría de los usuarios, la mayoría de los usuarios probablemente dirán "oh, sí, funcionó bien para mí en _____ búfer" sin tener una comparación cuantitativa con una docena de composiciones de búfer. No uso enzimas de restricción en mi trabajo, pero supongo que podrían suministrarlo con Triton X para que se disuelva cuando pueda adherirse al recipiente de suministro. Los otros tampones pueden funcionar bien, pero con un poco de Triton X confían en que todo estará en solución y, por lo tanto, resultará más confiable.
@canadianer Espero que obtenga el 100% de las unidades enumeradas como actividad en todos los búferes, pero puede obtener más actividad si usa el búfer único. ¿Quién podría necesitar esto? Ninguna pista...
@Chris En caso de que esté interesado, me comuniqué con el soporte técnico y actualicé la respuesta a continuación. Aparentemente, puede mostrar actividad estelar en los búferes universales a pesar de que esto no está en la lista.
@canadianer Genial, gracias. Encuentro esto interesante, y la sospecha de que podría tener que ver con la actividad estelar es correcta.

Respuestas (1)

La actividad hacia la secuencia de sustrato deseada no es la única preocupación al evaluar un sistema tampón de enzimas de restricción. Además, debe preocuparse por la llamada " actividad estelar ", o la actividad de la enzima hacia otras secuencias de nucleótidos no deseadas.

Por ejemplo, NEB proporciona un tampón específico de enzima para su EcoRI estándar , aunque enumera una actividad del 100 % en el tampón n.º 2 de la serie de tampones estándar de NEB. Pero en la parte inferior de la página, hay esta nota: "Puede exhibir actividad estelar en NEBuffer 2.1 o CutSmart Buffer".

Promega tiene una advertencia similar sobre su búfer "MULTI-CORE", aunque EcoRI tiene una actividad del 100% en ese búfer. No se recomienda el tampón MULTI-CORE debido a la actividad de las estrellas: escisión en sitios no estándar.

Está un poco oculto en la hoja de datos del producto, pero Thermo Scientific menciona la actividad de las estrellas en el búfer estándar "Tango" y menciona la actividad de las estrellas con sobredigestión en el búfer estándar "R". No hay advertencia sobre el búfer "O", pero dada la propensión de EcoRI a la actividad de las estrellas, supongo que esto es parte de por qué recomiendan un búfer único para el uso de rutina. Dada la frecuencia con la que se usa EcoRI en biología molecular, vale la pena usar un búfer personalizado para que la actividad de la estrella sea lo más baja posible.

De canadiense: me puse en contacto con el soporte técnico de Thermo. A pesar de que la actividad estelar no figura como una preocupación para 2X Tango o Buffer O en los datos del producto para EcoRI, dicen que en realidad puede mostrar algo de actividad estelar en estos búferes universales, razón por la cual continúan suministrando el búfer único. para esta enzima.

Gracias por tu respuesta. Debería haber aclarado en mi pregunta que Thermo no indica actividad estelar tanto para Buffer O como para 2X Tango. Como mencioné en los comentarios, sospecho que puede tener razón en que la actividad de las estrellas se minimiza en el búfer único, mientras que puede haber un grado más alto (¿insignificante?) En los búferes universales.
¿Por qué se suministra EcoRI con un búfer único cuando supuestamente es 100 % activo en búferes universales?
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