¿Qué herramientas pueden ayudarme a determinar si una proteína homóloga de planta interactúa con un ncRNA de la misma manera?

Primera publicación aquí, así que ten cuidado conmigo si violo alguna regla de etiqueta o formato.

Digamos que tengo una proteína en humanos. Cuando interactúa con un ncRNA que se encuentra en humanos, hace algo que me interesa mucho. Veo una proteína altamente homóloga (~85% de identidad AA) en las plantas, y está ampliamente conservada. Estoy interesado en obtener la misma actividad de esta proteína en las plantas. El único problema es que no hay ncRNA nativo producido en plantas que interactúe con mi proteína de interés de la misma manera. Así que tuve una idea:

¿Qué sucede si introduzco una transcripción a las plantas que aborde este problema? Si la versión vegetal de esta proteína interactúa con este ARN (introducido) de la misma manera, será genial. Me gustaría probar esta hipótesis con algunas construcciones sintetizadas. Pero antes de gastar miles de dólares en algunas construcciones, me gustaría explorar cualquier herramienta predictiva o analítica para fortalecer el caso. Soy consciente de que las probabilidades están en mi contra.

¡Gracias!

No puedo pensar en ninguna herramienta predictiva, pero creo que primero debería simplificar el sistema tanto como sea posible. En lugar de tratar de expresar el ncRNA en la planta, obtenga la proteína vegetal purificada y el ncRNA purificado, tal vez mediante transcripción in vitro. Mezcle los dos y vea si puede usar la coprecipitación o la reticulación o algo para buscar la unión. La anisotropía fluorescente podría ser genial si tiene un fluorímetro con polarizadores, podría etiquetar el ARN con un fluoróforo, luego medir la velocidad de rotación, una vez que se une a la proteína, la rotación debería disminuir. Utilice la proteína humana como control.

Respuestas (1)

La secuencia de ncRNA de humanos puede unirse a la proteína vegetal en las células vegetales, pero ¿y qué? Es posible que pueda decir que la proteína vegetal funciona como proteína de unión al ARN, pero no más que eso. Otra preocupación es que la proteína vegetal puede no reconocer la misma secuencia de ARN que la proteína humana.

Hay varias formas de encontrar socios de ARN de proteínas de unión a ARN.

SELEX

Este método se utiliza para encontrar secuencias de consenso que su proteína reconozca in vitro. Una vez que encuentre secuencias de consenso, puede buscar ncRNA de la planta.

ACORTAR

Esto es similar al ensayo Chip. Podría encontrar objetivos reales de sus proteínas de unión al ARN

Con mi plan experimental, planeo usar una transcripción de reportero. Podré decir más que "es una proteína de unión al ARN". Mi principal preocupación es precisamente que la "proteína vegetal puede no reconocer la misma secuencia de ARN que la proteína humana", si es que la reconoce. SELEX y CHIP probablemente me ayudarán en mi objetivo aquí. Gracias por tus sugerencias.
Tendría cuidado al usar SELEX para encontrar ARN endógenos que se unen a la proteína, probablemente encontraría un aptámero de ARN que se une bien a la proteína, pero no hay garantía de que el ARN resultante realmente se una de manera relevante, o simplemente sea una novedad. secuencia que se une bien. Ser capaz de hacer que un ARN se una a casi cualquier cosa es la razón por la que SELEX es tan útil.
¿Qué herramientas pueden ayudarme a determinar si una proteína homóloga de planta interactúa con un ncRNA de la misma manera?
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