Problema de clonación. La prueba de digestión al final de la clonación es siempre negativa.

Tengo un problema con mi clonación, estoy tratando de clonar un 483 pb en un vector pSecTag con sitios de restricción HindIII y BamHI. Estos son los procedimientos que estoy haciendo:

• Introduzco los sitios de restricción BamHI y HindIII en mi inserto mediante PCR con Pfu (polimerasa de extremo romo) y lo purifico en gel.
• Cloné mi inserción en un vector pJET1.2/blunt. Obtengo suficientes colonias y probé algunas de ellas con un cebador de inserción interno y un cebador de vector a través de PCR. Los resultados son positivos.

El problema surgió cuando digerí mi inserción de pJET e intenté clonarla en un vector pSecTag.

• Digiero mi inserto y el vector con HindIII y BamHI en Buffer Red durante 1.5h a 37ºC (fermentaciones). Purifico el inserto y el vector del gel y verifico que todos los fragmentos tengan el tamaño correcto en un gel. Todo correcto.

• Realizo la ligadura (ADN ligasa T4) usando un Insert:vector 5:1 y menos de 100 ng de ADN total. La ligadura (20ul) se realiza a 22ºC durante 30 minutos. Obtengo pocas o no colonias transformantes. Cuando consigo colonias, las pruebo por PCR:

** • Con cebadores internos, el resultado es positivo

  • Con un cebador para el vector el resultado es negativo.
  • Lo más extraño es que cuando uso cebadores pJET que no hierven en el pSecTag obtengo resultados positivos.**

Para la transformación estoy usando DH5-alfa quimiocompetente, con un choque térmico de 42°C a los 45 segundos. Probé las bacterias con un plásmido antes de usarlas.

Cambio de condición varias veces pero siempre obtengo el mismo resultado. Sigo todos los protocolos pero no llego a mi construcción.

¿Alguien sabe dónde está el problema? Gracias.

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Parece que el inserto todavía está en pJET, ¿no es así? ¿Hay alguna posibilidad de que haya mezclado los dos vectores en algún lugar de su paso de purificación después del resumen? En lugar de PCR, podría intentar hacer un mapa de restricción.
Gracias por sus respuestas Sí, el inserto todavía está en el pJET. Una de las veces que me pasó esto, lo digerí y las bandas se correspondían con mi inserto y el pJET. Lo envié en secuencia y el resultado fue el mismo. No hay posibilidad de haber mezclado los vectores, dados los problemas que he tenido he estado haciendo los pasos en días diferentes para evitar cualquier tipo de malentendido en la manipulación.
¿Por qué lo estás clonando primero en pJET?
No puedo digerir mi inserto de PCR directamente, el RE no puede cortar.

Respuestas (1)

Incluso pequeñas cantidades de vector sin digerir contaminarán su transformación. Puede amplificar por PCR su inserto del plásmido de clonación pJet y luego digerir el producto de PCR con BamHI y HindIII. Para deshacerse de la plantilla de pJet, purifique con gel el inserto digerido, digiera pJet con algunas veces, lo que lo corta varias veces (menos preferible) o coloque todo en una columna y espere que pJet se diluya lo suficiente (menos tiempo pero un poco arriesgado).

La otra cosa que podría explotar es que pJet es resistente a la ampicilina, mientras que su vector objetivo también es resistente a la zeocina. Si agrega Zeocin a su E. Coli, matará los clones positivos de pJet y no afectará a los clones positivos de pSecTag.

Su inserto es bastante pequeño, por lo que usar un poco más de ADN de lo habitual no le hará daño.

Si puede publicar algunas fotos de sus geles, esto también podría ser útil.

Muchísimas gracias. Estaba pensando en hacer eso, amplificar por PCR, digerirlo y purificarlo del gel. O también prueba la digestión secuencial. Debo tener alguna contaminación pero es difícil saber dónde. Subiría alguna foto de los geles pero no se como.
Problema de clonación. La prueba de digestión al final de la clonación es siempre negativa.
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