¿Son activas las enzimas de restricción a -20 °C?

Digerí mi ADN con la enzima NotI y lo puse en el congelador a -20 °C sin que el calor lo inactivara. ¿Pueden las enzimas de restricción funcionar a -20 °C? ¿Debo esperar actividad STAR?

Todavía recomendaría inactivar la enzima o limpiar la reacción después de descongelar.
¿Qué es la actividad estelar? por favor, evite los acronms amap gracias a los demás t bcms unintellgbl
La actividad de @AliceD Star es un término bastante común. Se refiere a la digestión no específica por enzimas de restricción.
La actividad de @AliceD Star no es un acrónimo, es simplemente una jerga de enzimas de restricción. -editar- ninjad.
las mayúsculas hacían que pareciera un acrónimo :) Gracias chicos

Respuestas (2)

Las enzimas tienen una temperatura óptima según el organismo del que se aislaron. Por lo tanto, predeciría que prácticamente no hay actividad a -20 °C. Otra consideración es que es probable que las reacciones se congelen, lo que limitaría la difusión y también la ralentizaría. Pero la verdadera pregunta es: ¿a qué le tienes miedo? ¿Solo la actividad estrella? Incluso si hubiera actividad estelar, ¿eso afectaría negativamente a sus experimentos?

No sé, nunca antes había tenido actividad estelar. Su respuesta tiene sentido y yo también pienso así, pero publiqué la pregunta aquí porque no había una respuesta a esto en Internet y pensé que tal vez alguien aquí tiene una experiencia al respecto.
@mdperry Debería actualizar eso en su respuesta y quizás incluir algunos extractos, es una gran adición.

Si bien es poco probable que haya actividad cuando la enzima está congelada, existen mejores métodos para prevenir la actividad de las estrellas.

1: Si está ejecutando la reacción en una máquina de PCR, puede programar la máquina antes de la digestión para calentar hasta 65 grados durante 10 minutos después del tiempo de digestión previsto para inactivar NotI por calor. Dado que NotI es una enzima lábil al calor , esto evita la actividad de las estrellas desnaturalizándolas.

2: Puede usar NotI-HF , que ha sido diseñado por NEB para reducir en gran medida la cantidad de actividad de las estrellas y, por lo tanto, puede dejarse incubando a 37 °C durante la noche.

3: Puede purificar en gel o realizar una "purificación por PCR" en sus muestras de ADN digeridas, esto también elimina cualquier proteína presente y, por lo tanto, evita la actividad de las estrellas.

@WYSIWYG ¿Por qué las comillas de miedo, sin embargo?
Además, puede ejecutar la reacción en tubos de PCR en el termociclador. Simplemente elija la temperatura que desea tener y luego aumente hasta 10 minutos a 65 ° C después. No se necesita trabajo adicional y es muy conveniente.
@Chris Eso fue exactamente lo que quise decir. Lo siento por no estar claro. Respuesta editada.
@Chris WYSIWYG editó la respuesta a "purificación de PCR" (puede consultar el registro). No estaba seguro de por qué esto fue formateado como tal.
Ah, ahora. Por lo general, realizo estas reacciones en tubos de PCR en el termociclador, porque el volumen es pequeño de todos modos y es muy conveniente.
@MarchHo las comillas porque no es realmente un nombre estándar del procedimiento, supongo. Este término es popularizado por Qiagen :P Puedes eliminarlo si quieres.
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