Enzimas de restricción, ¿cómo se determinan las secuencias de reconocimiento?

Este documento describe un método simple para determinar los sitios de restricción, que se utilizó para determinar la secuencia de restricción de la enzima previamente no caracterizada de Haemophilus gallinarum .

En resumen, una secuencia conocida de ADN (del fago$\phi \text{X174}$) se digiere parcialmente con la enzima de restricción, y los diversos fragmentos digeridos se pueden usar para determinar las distancias relativas entre cada uno de los sitios de restricción.

Luego, los fragmentos de restricción se extienden usando polimerasa T4 y se secuencian usando$^{32}\text{P}$etiquetado como secuenciación de Sanger .

Una vez que se completa el mapa de restricción de la enzima en la secuencia de ADN conocida, se pueden verificar las similitudes de los fragmentos individuales. Por ejemplo, Hga I tiene un sitio de reconocimiento fuera del sitio de restricción. Por lo tanto, cuando se comparan los sitios de restricción individuales, se puede ver que todos ellos tienen el sitio de reconocimiento GACGC.