¿Cómo clonar y secuenciar un transcrito de un gen de secuencia desconocida?

¿Cómo podría amplificar una transcripción genética (ARNm) de tejido animal del que se sabe poco sobre el genoma? En algunas aplicaciones, he usado PCR con transcriptasa inversa para amplificar todas las transcripciones de ARNm de células cultivadas, pero esto requería que conociera la secuencia para amplificar por PCR.

¿Cómo hago esto sin el conocimiento del gen o la transcripción?

¿Conoces la función del gen? ¿Cuál es el propósito de su experimento?
Sé que es una hormona endocrina, y puedo establecer paralelos con la endocrinología humana, pero más allá de eso, no sé mucho al respecto (y tampoco parece haber mucho en la literatura). El propósito realmente es solo ver qué tan conservados están los ortólogos de mamíferos en comparación con los lagartos.
Tener la secuencia hormonal ayuda un poco. Si bien no es del todo imparcial, podría intentar enriquecer su secuencia amplificando desde una región conservada.
Ya, bobthejoe tiene razón: solo busque en google 'clonación basada en homología'
@bobthejoe: gracias, buscaré la clonación basada en homología. Sospecho que hay una buena cantidad (50%) de conservación entre los humanos y los lagartos, así que veré si esta vía puede producir un resultado significativo.

Respuestas (1)

Quizás pueda inspirarse en el artículo clásico sobre la clonación lambda: Maniatis T, Hardison RC, Lacy E, Lauer J, O'Connell C, Quon D, Sim GK, Efstratiadis A. 1978. El aislamiento de genes estructurales de bibliotecas de ADN eucariótico. Celda 15: 687–701.

Intente seleccionar tejidos del animal que crea que están "enriquecidos" (es decir, altamente expresados) para el gen específico que está buscando. Esto podría tomar un poco de adivinanzas. Por ejemplo, si el gen A está muy expresado en el tejido B, entonces puede "suponer" que la mayoría de las transcripciones de ARNm serán para el gen A. Realice una purificación de ARN, RT-PCR y clone el ADNc en vectores lambda y recoger placas. Con un poco de suerte, podrá identificar el gen mediante la clonación, la hibridación y el "recorrido" cromosómico posterior para determinar su origen estructural.

¡Esto se hizo en el pasado para identificar nuevos genes mucho antes de la genómica, la secuenciación o incluso la PCR!

Eso es muy bonito. Gracias por la referencia y explicación jp89.
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