PCR multiplex, ¿el amplicón más corto inhibe al amplicón más largo?

Quiero ejecutar múltiples PCR para mi genotipado, con un par de cebadores dirigido a mi construcción y un par de cebadores dirigido a algún gen de mantenimiento (una especie de control incorporado).

Diseñé el amplicón de control para que fuera muy corto (probé 3 pares de cebadores con amplicones de ~120, 85 y ~50 pb, respectivamente). La razón principal detrás de esto es que, por lo general, mis amplicones son ~ 200-400 pb, y quiero algo claramente distinguible, pero más corto que más largo (quiero mantener mis opciones abiertas para amplicones objetivo más largos).

En cualquier caso, independientemente del par de cebadores de control que use, cada vez que intento multiplexar solo termino viendo el amplicón más corto. Vea la imagen del gel a continuación para ver un ejemplo (carriles: 1-escalera, 2,3-objetivo+control, 4,5-control, 5,6-objetivo).

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Veo que los carriles 2,3 tienen una mancha adicional muy débil en comparación con el 4,5, pero quiero una banda para mi amplicón objetivo. Además, mis bandas más cortas están bastante borrosas.

Además, solo como referencia, mis amplicones no se superponen en absoluto.

Entonces, supongo que mis preguntas son:

  • ¿Por qué está desapareciendo la banda más larga?
  • ¿Por qué la banda más corta está tan borrosa?
  • ¿Qué puedo hacer para evitar que ocurra este formulario?
¿A qué distancia están el constructo y el gen de limpieza uno del otro? Si están cerca, es posible que se produzcan interferencias en la transcripción.
Mientras los amplicones no se superpongan, no veo cómo podría haber una interferencia directa. En cualquier caso, no se superponen y se encuentran en cromosomas diferentes.
La superposición no es necesaria para que ocurra una interferencia en la transcripción, pero dado que sus genes están en diferentes cromosomas, no debería ser el caso. ¿Esta configuración funcionó antes o este es el primer uso de este conjunto de cebadores?
¿Cuáles son los T metro de estos pares de cebadores? Si un par de cebadores es significativamente más estable a una temperatura dada, podría explicar sus resultados.
58-60°C para todas las imprimaciones. Las 3 PCR se realizan en las mismas condiciones. ¿Diría que no queda polimerasa para ser reclutada por los cebadores menos estables?
El amplicón de 50 pb no es una buena idea. Se verán como dímeros de cebadores.
Es cierto, supongo que eso puede volverse problemático si alguna vez termino usando cebadores dimerizantes. Aún así, el mismo problema ocurre con 120 y 85 pb. De hecho, la cifra que ves aquí es de 85 pb.

Respuestas (1)

resulta que el T metro fue de hecho el problema, o más bien, que el algoritmo de cálculo sobreestimó el T metro del par de cebadores para el amplicón más largo (o subestimado el del más corto). En cualquier caso, parece que a 60°C los cebadores de amplicón más cortos secuestran el mecanismo de polimerización.

Establecer la temperatura de la fase de recocido en 55°C resolvió mi problema y ahora obtengo mejores resultados consistentemente:

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