PCR doble con cebador de cola

Me gustaría hacer una PCR doble con cebador de cola universal. La primera PCR produciría un amplicón con cola. La segunda PCR generaría un fragmento marcado con colorante fluorescente. Aquí está mi protocolo. ¿Podrías decirme si estoy equivocado?

  • ¿Mi segundo cebador directo de PCR está bien diseñado para encajar con la cola?
  • ¿Cuál sería la proporción de cebador a usar si quiero fusionar los dos PCR en uno?

Puño PCR (obras)

En negrita tienes la cola M13(-20)

Adelante: 5'- GTAAAACGACGGCCAGT TCTGCAGTTGTACTGAGTGAA-3'
Atrás: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Mezclar para 1 muestra

  • Agua = 15,8 µL
  • MgCl2 (25mM) = 18µL
  • Tampón (5x) = 6 µL
  • dNTP (4 mM) = 1,5 µL
  • Adelante (20pmol/µL) = 1µL
  • Inverso (20pmol/µL) = 1µL
  • GoTaq (5U/µL) = 0,15 µL
  • ADN (50ng/µL) = 1 µL

Segunda PCR (no funciona = no hay señal de fragmento)

Avance: 5'-[FAM]- GTAAAACGACGGCCAGT -3'
Retroceso: 5'-AAAGCGTGCAGCTGATATTT-3'

Mezclar para 1 muestra

  • Agua = 15,8 µL
  • MgCl2 (25mM) = 18µL
  • Tampón (5x) = 6 µL
  • dNTP (4 mM) = 1,5 µL
  • Adelante (20pmol/µL) = 1µL
  • Inverso (20pmol/µL) = 1µL
  • GoTaq (5U/µL) = 0,15 µL
  • ADN (50 ng/µL) = 1 µL de mi amplicón anterior
¿Estás obligado a usar el reverso así? Me han enseñado a evitar extremos A/T y tramos de más de 3 C/G o A/T consecutivos; tu reverso tiene ambos. Además de eso, ¿probó un gradiente para la temperatura de recocido?
¡No, puedo cambiar la imprimación! Gracias por su consejo.

Respuestas (1)

No estoy seguro de entender tu consulta. Puedo decir que en mi laboratorio también estamos usando tinte fluorescente (para la detección de SSR). Pero lo estamos haciendo con un enfoque de un solo paso:

Nuestros cebadores directos son como el suyo, precedidos por la secuencia fluo (cebador directo M13). Pero en lugar de hacer una segunda PCR, agregamos directamente el cebador fluo (llamémoslo M13-FAM) en la primera PCR. Es MUY importante poner su cebador M13-forward en menor cantidad que el inverso (factor 10 para mí). Para lograrlo, uso soluciones de imprimación de 0,1 mM y mezclo mis imprimaciones antes

Para 96 ​​pocillos (20 µL/pocillo)

Mezcla de imprimación

  • 1,25 µl de cebador M13-F
  • 12,5 µL de cebador R
  • 240 µL de agua

Mezcla PCR

  • 200 µL de mezcla de imprimación
  • 20 µL de M13-FAM
  • Mezcla maestra 1mL
  • Agua 1mL
Gracias ! Respondes perfectamente a mi pregunta! Primero estaba haciendo 2 PCR para comprobar mis cebadores. Pero mi objetivo final es lo que hiciste. ¿Me podrías dar tus primers? Para comprobar si no me equivoco? No estoy seguro si M13-tail primer y M13-FAM tienen que estar en la misma orientación 5'-3'
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