Pantalla de fagémidos

Encontré un artículo en Nature:

Un fago auxiliar para mejorar la presentación de anticuerpos monocatenarios en la visualización de fagos

protocolo experimental

Se llevaron a cabo procedimientos de clonación estándar, determinación de unidades formadoras de colonias y unidades formadoras de placa, e inmunotransferencia después de PAGE de acuerdo con Sambrook et al.

Construcción de la línea de celdas de empaque.

DH5alfa/pIII [M13KO7DeltapIII]. El gen M13 pIII fusionado con el promotor P/A1/04/03 (ref. 17) se insertó en el sitio de clonación múltiple del plásmido lambdaattP pLDR9 (ref. 18). Se cortaron el origen de la replicación y el gen de resistencia a la kanamicina y se volvió a ligar el ADN no replicativo de lambdaattP-pIII restante. Se transformó Escherichia coli DH5alfa que contenía el plásmido pLDR8 (ref. 18) con el ADN no replicativo lambdaattP-pIII y se sembró en placas de agar que contenían 25 µg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 42°C, las colonias obtenidas se replicaron en placas y se identificaron los clones resistentes a la ampicilina, denominados E. coli DH5alpha/pIII. Posteriormente se transformaron con M13KO7DeltapIII, dando como resultado la línea celular de empaquetamiento E. coli DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII].

Producción de fagos.

Para obtener el fago auxiliar M13KO7DeltapIII, se electrotransfectó ADN de M13KO7DeltapIII en E. coli K802 que contenía pNDI (ref. 15). Para obtener hiperfago, se electrotransfectó ADN de M13KO7DeltapIII en E. coli DH5alpha/pIII. Los fagos se produjeron mediante cultivo en presencia de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) 0,5 mM a 30 °C durante 24 h con agitación a 200 rpm Escherichia coli Top10F' o E. coli Xl1blue que lleva el fagémido pSEXphOx(Yol) o una biblioteca de scFv en pSEX81, respectivamente, se infectaron con una preparación de fagos auxiliares a una DO600 de 0,1 con una multiplicidad de infección de 20 como se describe.

Cuantificación de fagos por ELISA.

Las series de dilución de fagos se recubrieron con NaHCO3 100 mM, pH 8,6 en placas MaxiSorb ELISA (Life Technologies, Karsruhe, Alemania) durante 16 ha 4ºC. El bloqueo se realizó con leche en polvo descremada al 2% en PBS (NaCl 137 mM, KCl 3 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1 mM, pH 7,3) durante 2 h a temperatura ambiente. Los fagos se detectaron con el anticuerpo monoclonal de ratón B62-FE2 (Progen, Heidelberg, Alemania) que se une específicamente a un epítopo en la proteína principal de cubierta pVIII del fago M13. El fago M13KO7 de unidades formadoras de colonias conocidas se utilizó para la estandarización.

inmunotransferencia

Se aplicaron aproximadamente 1010 fagos por carril en un gel de poliacrilamida al 10%. El bloqueo se realizó con leche en polvo descremada al 2% en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. La inmunotinción se realizó con el mAb de ratón anti-g3p (MoBiTec, Göttingen, Alemania) que reconoce la proteína de cubierta pIII de M13KO7, visualizada con sustrato 3,3', 5,5'-tetrametilbencideno (TMB) (Promega, Madison, WI).

ELISA de fagos de unión a antígeno.

Se recubrieron series de dilución de antígeno BSA-phOx en NaHCO3 100 mM, pH 8,6, en placas MaxiSorb ELISA (Life Technologies) durante 16 ha 4ºC. Después de bloquear la unión inespecífica con leche en polvo descremada al 2 % en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente, se aplicaron 2 veces 109 fagos de cadena simple diluidos en leche en polvo descremada al 2 % en PBS a cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar seis veces con 400 μl de PBS por pocillo, los fagos unidos se detectaron con mAb B62-FE2 como se describe anteriormente.

Panorámica.

Se generó una biblioteca de fragmentos de scFv humano en pSEX81 con una complejidad máxima calculada de 2 veces 107 a partir de preparaciones de linfocitos periféricos como se describe21. La toxina tetánica obtenida de Virotech (Rüsselsheim, Alemania) se revistió en seis pocillos ELISA (Life Technologies) a una concentración de 0,1 µg/ml en NaHCO3 100 mM, pH 8,6, durante 16 ha 4 °C. Los pocillos se bloquearon con leche desnatada al 2 % en PBS durante 2 ha temperatura ambiente, después de lo cual se aplicaron 1011 fagos de la biblioteca a cada pocillo y se incubaron a 4 °C durante la noche. Después de cinco lavados con PBS/Tween al 0,1 % y cinco con PBS, los fagos unidos se eluyeron con 1 ug/ml de tripsina (Life Technologies) en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. El fago eluido se utilizó para la infección de 20 ml de E. coli XL1blue a una DO600 de 0,4.