Inversión de entrecruzamiento en ChIP-seq

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un tipo de técnica experimental de inmunoprecipitación utilizada para investigar la interacción entre las proteínas y el ADN en la célula. Un resumen del protocolo para ChIP está aquí . Brevemente, los pasos son:

  1. El ADN y las proteínas asociadas en la cromatina de las células o tejidos vivos están entrecruzados;
  2. Los complejos de ADN-proteína se cortan en fragmentos de ADN de ~500 pb mediante sonicación o digestión con nucleasa;
  3. Los fragmentos de ADN entrecruzado asociados con la(s) proteína(s) de interés se inmunoprecipitan selectivamente a partir de los restos celulares utilizando un anticuerpo específico de proteína apropiado;
  4. Los fragmentos de ADN asociados se purifican y se determina su secuencia.

Después del paso 3 (inmunoprecipitación del complejo proteína-ADN), tengo entendido que el entrecruzamiento proteína-ADN se invierte y las proteínas se eliminan mediante digestión con proteinasa K.

¿Alguien puede decirme si durante este paso el ADN en el sitio de entrecruzamiento se incluye en otro paso de secuenciación o se elimina con la proteína misma?

¡Bienvenido a Biología.SE! He arreglado un poco la pregunta, espero que las ediciones estén bien.
Entonces, ¿quiere saber si en el paso de reversión del entrecruzamiento se pierde el ADN?
Sí. Más específicamente en el punto donde se une la proteína y el ADN.

Respuestas (1)

Después del paso de inversión del entrecruzamiento, todavía tiene algo de ADN conectado a fragmentos de proteína.

Entonces, en ese paso, en lugar de hacer una purificación de ADN normal, también necesitamos usar una extracción con fenol-cloroformo o columnas especiales para separar el ADN de los fragmentos de proteína.

Thermofisher suele dar muy buenas explicaciones también.

¡Avísame si no entendí bien la pregunta! :)

Inversión de entrecruzamiento en ChIP-seq
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v