Estamos tratando de averiguar si el aumento o la disminución de la concentración de calcio citoplasmático afecta la interacción de dos proteínas, utilizando co-IP en células HEK293T como lectura.
En diferentes foros y artículos he encontrado que para aumentar los niveles de Ca2+ citoplasmático en células no excitables, existen tres categorías principales de compuestos. Ionóforos (A23187, Ionomicina), Agonistas de la señalización de InsP3-PKC (carbacol, ATP) e inhibidores de SERCA (Thapsigargin, CPA).
Sin embargo, diferentes documentos y diferentes personas usan diferentes concentraciones y duraciones de los tratamientos. Dado que muchas de las drogas generan picos bastante transitorios, me doy cuenta de que el momento es crucial aquí. Dado que no tenemos los recursos para la optimización de las imágenes de colorantes sensibles a [Ca2+], también me pregunto si existe una forma más sencilla de evaluar aproximadamente [Ca2+], tal vez mediante el análisis de un marcador de proteína/ARN mediante Western Blot o qPCR?
¡Muchas gracias!
Hasta donde yo sé, la microscopía (ya sea con tintes como el flúor o con indicadores de calcio codificados por el genoma) es realmente la única buena opción, especialmente para obtener sensibilidad cuantitativa, que creo que es lo que está buscando. Los cambios en el calcio citosólico son increíblemente dinámicos tanto en el tiempo como en el espacio, lo cual es algo a tener en cuenta cuando se pregunta cómo afecta el calcio a sus dos proteínas.
Conozco un ejemplo en el que los investigadores transfirieron células a tampones con diferentes concentraciones de Ca2+ y las permeabilizaron con un detergente suave para elevar los niveles de calcio (Borges-Pereira et al 2015). No estoy seguro de si eso funcionaría para su sistema, pero vale la pena echarle un vistazo, ya que creo que eleva los niveles de manera bastante suave y constante, y tiene una mejor idea de cuál será su concentración intracelular sin visualizar directamente él. Teniendo en cuenta que no podrá saber la concentración de Ca2+ en un momento dado sin microscopía, cosas como SOCE y las tasas de quelación intracelular pueden ser importantes, por lo que querrá estar atento cuando después del tratamiento comience su análisis, tal vez probando una algunos puntos de tiempo diferentes
Espero que haya sido de alguna ayuda!