¿La fijación de metanol deforma las células cultivadas?

Utilizo la fijación de metanol (@ -20⁰C durante 10 minutos) cuando realizo ensayos de inmunofluorescencia en células cultivadas. En términos generales, esto da como resultado una muy buena tinción de anticuerpos. Sin embargo, las células tienden a tener un aspecto marcadamente diferente al que tenían bajo el microscopio de contraste de fase antes de la fijación. Esto tiene a mi PI preocupado por cómo los revisores recibirán estas imágenes.

¿Cómo funciona un fijador de metanol y por qué provoca un cambio en la morfología celular? ¿Existen parámetros que se puedan ajustar para mitigar este efecto?

Dame un último dato y reescribiré por qué MtOH causa cambios en la morfología celular, por qué realmente creo que deberías usar acetona y la información de desenmascaramiento que ya puse. ¿En qué estás cultivando las células y en qué las estás fijando? ¿Es un portaobjetos de cámara de PP, trans-bueno, qué? La solución directa de un problema específico es la piedra angular de los sitios SE, consulte el desbordamiento de pila si aún no lo ha visto. Si desea una respuesta más general, prepárese para mostrar la investigación que ya ha realizado para responder la pregunta usted mismo.

Respuestas (1)

Sí, la fijación de casi cualquier tipo puede tener efectos sobre la morfología. Cuando tomas una gota de grasa rica en proteínas que fluye libremente (es decir, la membrana celular) y la vuelves rígida, obtendrás algunas diferencias.

Se puede hacer una visualización divertida de esto envolviendo una pipeta serológica en papel celofán/envoltura retráctil y sumergiéndola en un baño de metanol y hielo seco. Es algo que muestro a los estudiantes todo el tiempo antes de comenzar el trabajo de histología.

Vuelve a lo que necesitas. ¿Qué células estás usando y en qué las estás cultivando? ¿Has probado la fijación con acetona y sabes que destruyó tu plástico? La cantidad de tiempo y concentración necesaria para la fijación de acetona es lo suficientemente baja como para que la mayoría de los portaobjetos de cámara modernos puedan manejarlo. ¿Necesitas permeabilizar la membrana en la fijación?

No sé el efecto principal que está midiendo, pero suponiendo que tenga buenos controles, debería poder verlo más allá de la fijación. El efecto en sus controles debe ser similar a sus grupos tratados, a menos que el fijador efectúe específicamente el tratamiento.

Pasando a algunas recomendaciones más generales. Creo que debería reconsiderar los fijadores que ha descartado, porque no estoy seguro de su aplicación. La fuente base que siempre recomiendo a los estudiantes que consulten es el libro de Wiley "Protocolos actuales en X" que es relevante para la tarea en cuestión. En este caso, creo que el texto más relevante es Current Protocols in Immunology , y la unidad adecuada es 21.4 " Inmunohistoquímica ".

Creo que una tabla particularmente útil y relevante para esta pregunta si le preocupa el enmascaramiento con formalina es la Tabla 21.4.3.

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Eso es para antígenos humanos, pero el proceso de " recuperación de antígenos " funciona para células murinas en la mayoría de los casos. Tiene razón en que la formalina podría bloquear su antígeno, pero la solución a menudo es desenmascarar, ya que el MtOH suele ser más duro para la morfología. Para admitir el protocolo 1:

La fijación con formalina o paraformaldehído entrecruza la proteína, lo que a menudo hace que los antígenos sean inaccesibles para anticuerpos específicos. El protocolo de recuperación de antígenos, que combina alta temperatura con tampones a diferentes pH, ha sido muy eficaz para desenmascarar determinantes antigénicos que pueden estar enmascarados en tejidos fijados o en preparaciones de células fijadas, en particular determinantes dentro del núcleo o el citoplasma (Taylor y Shi, 2013).

Mi modificación del protocolo es:

Tampón de citrato de sodio: ácido cítrico 0,1 M/citrato de sodio 0,1 M, pH 6,0

  1. Lave la muestra en un balancín de revestimiento durante 5 min con 2x volumen de cultivo de di H2O
  2. Coloque sus portaobjetos en tampón de citrato 1 mM en frascos Coplin con la tapa ligeramente abierta
  3. Pese el frasco en su estado final para saber cuánta agua debe volver a agregar
  4. Microondas 4-7 min. No querrás que hierva y debes recordar dejar espacio para la ventilación.
  5. Pese el frasco nuevamente y agregue agua nuevamente.
  6. Microondas otros 4-7 min, de nuevo no quieres que hierva
  7. Saque del horno y deje que alcance la temperatura ambiente colocándolo en el banco. Si lo hace demasiado rápido, romperá la membrana.
  8. Después de que vuelva a la temperatura ambiente, lave 2x PBS + 0.05% Tween20 durante 10 minutos cada uno
  9. Pruebe su IHC nuevamente, probablemente funcionará ahora.
Es un antígeno de superficie en el endotelio, así que intento dejar la membrana lo más intacta posible. La acetona arruina nuestros recipientes de cultivo bastante rápido. ¿Por cuánto tiempo arreglas? Generalmente estoy en contra del uso de kits. Son demasiado como una caja negra (una de las muchas razones por las que no me gusta el papel cada vez mayor y las prácticas comerciales dudosas de algunos proveedores). Si revisa la MSDS en ese kit de tecnologías de la vida, verá que el medio de fijación es solo formaldehído. Lo cual ya probé una vez, pero voy a intentarlo otra vez mañana.
@Chastain Primero, casi nunca debe usar formaldehído puro en un endotelio. Debería usar formalina tamponada, con una concentración de alrededor del 10%. En segundo lugar, ¿cuál es la fuente del tejido? (Animal/órgano)
También señalaré que junto con una formalina tamponada y tejidos de ratones BALB/c, vimos una conservación mucho mejor con el kit. Podría ser simplemente cómo están amortiguando las cosas. Publicaré los protocolos de MtOH y Acetona que uso después de mis reuniones matutinas.
Gracias. Es murino y está aislado de varios sistemas de órganos diferentes. Para ser claros, la pregunta no es sobre la morfología de la sección de tejido. La morfología del tejido seccionado y teñido es buena. Esta pregunta es específica de las células cultivadas. Cuál es una de las razones por las que es tan frustrante.
Esto quizás podría resolverse mejor a través del chat. La histología, la fijación y la IHC son cosas que deben optimizarse mucho. Mi tinción del epitelio pulmonar humano primario se modificó durante varios años y laboratorios. Entiendo que está tratando de reparar células cultivadas. ¿Es un sistema monocapa o transwell? Por el sonido de su último comentario, está co-cultivando múltiples tipos de células (ya que son de diferentes tejidos). ¿Son primarios o inmortalizados? Estoy tratando de brindarle una solución en lugar de una respuesta general sobre la fijación. Si no quieres 1, puedo escribir una respuesta detallada sobre la fijación.
Soy nuevo en el intercambio de pilas, así que tendré que descubrir cómo usar el chat. Sin embargo, para ser claros, y tal vez debería editar mi pregunta original para reflejar esto, estoy buscando el principio general. Me encanta conversar sobre mi trabajo, pero eso parece estar fuera del alcance del formato de preguntas y respuestas aquí. Quiero saber 1) si la fijación de metanol deforma una célula (¡creo que la respuesta ha sido un rotundo sí!), 2) cómo funciona la fijación de metanol y por qué deforma una célula, y 3) variables, si las hay, que mejoran o mitigan este efecto. Es importante para mí entender el principio en el trabajo aquí.
¿La fijación de metanol deforma las células cultivadas?
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