Me encontré con este pensamiento mientras estudiaba histología, ¿qué sucede con los anticuerpos marcados con fluorescencia que no se unen con un antígeno, podemos verlos? o son anticuerpos activados tras la unión al antígeno que, a su vez, activa la región Fc a la que se une la molécula de fluorescencia.
Con mucho, el protocolo IHC más común, en mi experiencia, es usar un anticuerpo primario que se une a su objetivo de interés, seguido de un anticuerpo secundario (que lleva la etiqueta fluorescente o la enzima de etiquetado) para unirse al anticuerpo primario.
Un protocolo de ejemplo de un fabricante se encuentra aquí:
Resumiendo:
Aplique los anticuerpos primarios diluidos en el tampón de incubación de acuerdo con las instrucciones del fabricante...
Lave los portaobjetos 3 veces durante 15 minutos cada uno en tampón de lavado.
Incube con el anticuerpo secundario NorthernLights™ diluido en tampón de incubación de acuerdo con las instrucciones del fabricante...
Lave los portaobjetos 3 veces durante 15 minutos cada uno en tampón de lavado.
Los pasos de "lavado" están destinados a eliminar del tejido cualquier anticuerpo primario que no esté unido y, posteriormente, cualquier anticuerpo secundario que no esté unido.
Todavía puede obtener algo de fluorescencia de fondo residual debido a la unión no específica del anticuerpo secundario o al anticuerpo primario no unido que no se lava (creo que en el uso típico, la unión no específica del anticuerpo secundario será el contribuyente más relevante al fondo, pero no conozco una buena cita para eso), pero usa pasos de "bloqueo" para intentar reducir el enlace no específico, y se supone que todo lo que queda contribuye a una mancha de fondo bastante uniforme.
Además, puede usar controles negativos que omitan el anticuerpo primario para estimar la unión no específica del anticuerpo secundario y comprobar si hay particiones inesperadas que puedan contribuir a una señal artificial.
doe pual