Estoy probando el nivel de fluorescencia de una muestra que tiene dsDNA, SYBR Green y agua miliq, pero tengo dificultades para elegir el volumen correcto de dsDNA y el nivel de contras de SYBR Green.
Detalles de la muestra : dsDNA: 1000 nano mole, SYBR Green: 1X (1000 veces diluido del stock original)
Muestra_1 : dsDNA (3ul) + SYBR Green (5ul) + miliq de agua (27ul)
Muestra_2 : dsDNA (3ul) + SYBR Green (5ul)
Resultado : en la primera muestra no obtuve ninguna señal, pero en el segundo caso la obtuve (pero quiero 5 veces más de lo que obtuve).
Por favor, dime cómo funciona y cómo estas cosas dependen unas de otras. No soy biólogo, si es posible sugiérame un recurso también.
Tuve que buscarlo en línea, pero finalmente encontré aquí una información importante: los límites de detección de SYBR Green.
dsDNA a 300nm transiluminación: 60 pg
Oligonucleótidos a 300nm transiluminación 1-2 ng
Primero debe verificar el tamaño de su ADN de interés y, a partir de su tamaño, calcular su peso molecular aproximado (por ejemplo, utilizando esta calculadora en línea ). Luego, debes verificar que 1000 nmoles de tu ADN correspondan a una masa mayor a 60 pg. De lo contrario, debe aumentar la cantidad de ADN en su ensayo en consecuencia hasta que la masa introducida en el ensayo supere el límite de detección de SYBR Green.
Ahora, ¿sabes la concentración de tu ADN? En otras palabras, ¿cómo eligió usar 3 uL de ADN? ¿Cómo sabes que estos 3 uL contienen suficiente material? (1000 nmoles como en su protocolo, o mejor, que sea más alto que el límite de detección en términos de masa).
Además, ¿usó la solución madre 1000X de SYBR Green sin dilución intermedia? Si es así, la concentración final de SYBR Green es mucho mayor que el 1X final que desea, en ambas muestras:
Lo que necesita es usar 1 uL de solución madre 1000X de SYBR Green + cualquier cantidad de ADN que esté por encima del límite de detección + tampón para ajustar el volumen a 1000 uL final (lo que llevará SYBR Green a 1X final), o haga una dilución intermedia adecuada de SYBR Green para que su concentración final sea 1X siguiendo la preparación de la muestra como se describe en su pregunta.
La preparación de la muestra que describe aquí produce una composición que está muy lejos de la sugerida por su protocolo, al menos para SYBR Green. Hasta que no vuelva a intentarlo con las concentraciones finales adecuadas, no llegue a la conclusión de que no funcionó. :-)
Buena suerte con tu proyecto.