Soy un estudiante de ingeniería que estudia cómo afectan los campos eléctricos a las células, específicamente los fenómenos de electroporación en las células vivas.
Sé que la electroporación se usa ampliamente para introducir genes en las células, pero ejecutar un experimento de transfección completo no es tan factible en el laboratorio en el que estoy trabajando.
Mi pregunta es:
Si quiero demostrar el principio de la electroporación, es decir, que las células se abren y toman sustancias del medio ambiente, mediante el uso de algún tipo de tinte que luego puedo visualizar, ¿cuál podría ser un buen modelo para este tipo de experimento? Específicamente, ¿qué tinte, qué células podrían usarse para esto?
Obtendrá una gran cantidad de falsos positivos con el siguiente método, y una transfección real de una proteína fluorescente siempre es el camino a seguir, porque entonces demostrará que la transfección fue realmente exitosa.
Dicho esto, podría intentar usar DAPI , seguido de microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. DAPI es una tinción muy brillante para el ADN y no puede atravesar una membrana celular intacta. Si la membrana celular se rompe, por ejemplo, por necrosis, DAPI entrará en la célula. Nunca he visto a nadie intentar probar la electroporación de esta manera, pero valdrá la pena intentarlo. Podría ser que el tiempo sea demasiado corto para que DAPI ingrese a la celda, por lo que deberá modificar su configuración.
Intentaría lo siguiente: preparar una solución celular con DAPI (algo así como una concentración de 5 µM debería ser suficiente). Divida la solución en dos cubetas de electroporación, realice la electroporación con una cubeta, deje la segunda intacta como control. Después de la electroporación, analice las muestras MOMENTÁNEAMENTE (es decir, en unos pocos minutos) utilizando un citómetro de flujo (si es posible).
En cuanto a las celdas, podrías usar cualquier cosa. Sugiero las células eucariotas porque son más fáciles de visualizar que las bacterias. Sin embargo, necesitaría una campana de flujo laminar para el manejo aséptico de las células. En teoría, también podría usar bacterias, que son más fáciles de manejar, pero no tengo experiencia con inmunofluorescencia en bacterias.
bobthejoe
Armatus