¿Funcionará esta estrategia para verificar la clonación exitosa de un fragmento de ADN en un vector de plásmido?

Así que estoy en un poco de limitación de tiempo. Esencialmente, inserté un fragmento de ADN mediante clonación molecular que contiene un sitio RE único. Necesito confirmar si mi colonia tiene o no el fragmento. Necesito hacer esto en un día, así que esto funcionaría como una estrategia de confirmación:

  1. Elija la colonia y realice la PCR de la colonia con cebadores alrededor del sitio RE.
  2. Limpiar el producto de PCR y digerir usando la enzima que se insertó.
  3. Ejecutar en un gel. Si se nota un corte, esto confirma que la colonia tenía el fragmento insertado (que contiene el sitio RE).

¿Funcionaría esta estrategia? ¿Hay algún problema notable que la gente pueda ver en esta estrategia?

Respuestas (2)

Sí, su estrategia funcionaría, con las advertencias ya mencionadas por @Cell.

Dependiendo de la enzima de restricción y el búfer de PCR que use, es posible que incluso pueda omitir el paso 2. NEB tiene una buena lista sobre sus enzimas de restricción y sus actividades en algunos búferes de PCR comunes. Con algún razonamiento, esa información a menudo también se aplica a las enzimas de restricción de otras marcas.

Dependiendo de la disponibilidad de su cebador, otra estrategia rápida es simplemente usar un par de cebadores de modo que un cebador se una dentro de su fragmento y el otro se una a la columna vertebral. Esto debería dar como resultado un producto de PCR solo si su clonación fue exitosa y también verifica la dirección correcta (en caso de que haya utilizado una clonación de extremo romo o de un solo sitio). Dos posibles problemas con este enfoque son:

  1. Si no obtiene ninguna banda, es posible que no sepa si lo que falló fue su clonación o la reacción de PCR. Este último se puede controlar fácilmente con un control de PCR positivo bien pensado.
  2. Es posible que detectes casos en los que se haya insertado más de una copia de tu fragmento. Aunque estos casos son raros, a veces sucede que se insertan en tándem repeticiones invertidas de 3, 5, 7, ... etc. copias.

Un problema es que si su fragmento amplificado es demasiado pequeño, es posible que no pueda ver el resultado positivo de dos bandas porque se escapan del gel. Además, es posible que el RE no corte un fragmento pequeño de manera eficiente.

Recomendaría extraer y purificar el plásmido, luego hacer una doble digestión usando el fragmento único que corta RE y un RE que solo corta la columna vertebral. Debería ver ADN de plásmido linealizado o dos bandas que probablemente sean > 1 kb y fácilmente resolubles.

Cuestionaría la eficiencia de corte ya que a menudo los productos amplificados por PCR tienen extremos de restricción y se clonan fácilmente en vectores.
Tal vez dependa de qué tan lejos estén sus cebadores, pero de acuerdo con este artículo de NEB, necesita algunas secuencias de ADN adicionales en ambos lados del sitio de corte para una división eficiente neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/… Dado que No especifiqué que asumí el peor de los casos en el que su sitio de corte se encuentra al final del producto amplificado.
Sí, generalmente son de 4 a 5 pb... mis cebadores de "doble verificación" amplificarían 500 pb de cada lado del sitio RE. Debe partirse bien. Además 1.000pb vs 500pb se notaría mucho
¿Funcionará esta estrategia para verificar la clonación exitosa de un fragmento de ADN en un vector de plásmido?
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