Determinación del bioconjugado apropiado

Estoy pensando en entrecruzar dos proteínas. Se conoce la naturaleza cristalográfica de la interacción y el motivo de unión para cada molécula. El documento dice que los contactos intermoleculares (más de 50; radio de van der Waals 5 angstrom) se realizan entre los motivos de estas dos proteínas. También sé que uno de los motivos en una proteína tiene un sulfhiril (metionina) y para el otro motivo en la otra molécula (creo) puedo usar restos reactivos de amida primaria. Ahora aquí es donde está mi pregunta.

¿Estaría en lo cierto al pensar que el mejor agente de entrecruzamiento para usar es un agente de entrecruzamiento heterobifuncional, con un espaciador de 10 (¿o 5?) angstrom para recoger esta interacción específicamente y estabilizarla?

Necesito desesperadamente una orientación sobre esto. Utilicé la herramienta de selección de reticulantes de Life Technologies y el manual de tecnologías de reticulación, pero no puedo descifrar con base en la información que tengo, qué longitud de reticulante necesito usar. No me preocupan los parámetros de escisión, solubilidad y permeabilidad de la membrana.

ACTUALIZAR:

Sé que el motivo de unión en la primera proteína tiene tirosina, prolina y metionina.

Mirando los contactos del surco, la segunda proteína está interactuando con este motivo, usando tirosina y glutamina, PERO la segunda proteína también tiene triptófano, lisina, ácido glutámico y metionina.

ACTUALIZACIÓN 2:

Encontré ácido glutámico (E) y leucina (L) especialmente cercanos en mi primera proteína, especialmente cerca de lisina (L) en mi segunda proteína, aunque no está en la secuencia de consenso para la segunda proteína. Están separados por menos de 10 angstrom. eso es mejor? Entonces, ¿presumiblemente puedo usar el enlazador homobifuncional?

Muchas gracias de antemano

¿Hay una cisteína disponible, o solo metionina? La metionina no será muy útil. ¿Qué pasa con las lisinas?
¿Son posibles las mutaciones específicas del sitio?
Además, ¿el enlace debe estar en el sitio de unión? Porque la química del bioconjugado generalmente no obtendrá ese tipo de especificidad si su aminoácido reactivo aparece en otra parte de la proteína.
No puedo hacer mutaciones puntuales, pero estaba pensando en hacer un enlace en el sitio de unión, ya que ese es uno de los puntos de contacto más cercanos que se conocen y, por lo tanto, usar un enlazador de 10 angstrom reduciría los enlaces no específicos. Soy completamente nuevo en los enlaces cruzados, por lo que agradecería cualquier orientación. Actualmente estoy planeando un enlazador homobifuncional de amida amida a 10 angstrom. Desde que calculé la distancia molecular de los residuos de unión en dos proteínas. Usé los datos de rayos X y SPDBV para los cálculos. ¿Es eso aconsejable?
Tu primera proteína es lo que me molesta. Es difícil trabajar con tirosina, metionina y prolina. En su segunda proteína, tiene una lisina, que sería útil. Si hubiera una buena amina en la primera proteína, podría usar un enlazador homobifuncional de éster NHS. El glutamato podría modificarse con EDC para hacerlo reaccionar con aminas. Si hay otras lisinas en sus proteínas, también se modificarán, es posible que no se entrecrucen con otra proteína, pero recogerán su reactivo de conjugación.
Met no contiene un sulfhidrilo, Cys sí.
He hecho una actualización. muchas gracias por la ayuda de todos hasta ahora :)
¿Podría explicar cuál sería el objetivo del estudio?
La unión del glutamato a la lisina podría ser posible mediante acoplamiento EDC. Reaccionaría con el glutmato para formar un éster activo, que podría reaccionar con la amina de la lisina. Sin embargo, podría ser demasiado reactivo para usarlo de manera segura en las células, y también reaccionaría con el agua, lo que limitaría su utilidad. Pero si las dos proteínas ya están unidas cuando agrega el reticulador, aumenta las probabilidades de un enlace exitoso y el EDC que reacciona con los residuos incorrectos podría hidrolizarse.
@ user137 ¡Eso responde la pregunta! Considere escribir esto como una respuesta para que pueda aceptarlo :) sería genial si pudiera incluir referencias a las variaciones de EDC que contienen un espaciador, si cree que es recomendable usarlo para proteínas que están separadas por aproximadamente 10 angstrom. También por lo que leí, EDC funciona en PBS, aunque con menor eficiencia, ¿verdad? Además, ¿conocería algún protocolo (tiempos de incubación, concentración, neutralización, etc.)? como dices la mejor estrategia es agregarlo a mis celdas que ya hicieron la conexion PP.

Respuestas (2)

Existen pautas generales para las interacciones proteína-proteína de entrecruzamiento, pero los parámetros específicos (es decir, los subtipos de entrecruzador, la longitud del espaciador, la concentración del enlazador, el pH y la temperatura de la reacción) a menudo se determinan experimentalmente. Los entrecruzadores de proteínas comunes se dirigen a grupos funcionales reactivos que se encuentran más probablemente en la superficie de la proteína que en su "sitio activo" o "interfaz" que a menudo está enterrado.

Dado su motivo de atracón relativamente hidrofóbico y no reactivo (Tyr/Pro/Met), si no necesita una gran cantidad de muestra de proteína reticulada, puede etiquetarla con un aminoácido fotoactivable como L-photo-Met . Dado que Met no se encuentra a menudo en la superficie, el entrecruzamiento interno estabilizaría su proteína y su compañero de unión.

Si necesita una gran cantidad de proteína reticulada (p. ej., en mg) para estudios estructurales adicionales, el etiquetado puede resultar costoso. Posiblemente podría entrecruzar el cristal de proteína (complejo) en sí mismo (ya que había cristales como mencionó), a menudo solo con glutaraldehído. Si el complejo está ahí en el cristal, ahora sería tan sólido como una roca.

Sin embargo, el glutaraldehído probablemente eliminaría cualquier actividad, por lo que el mejor método depende de para qué se usarán las proteínas. Eché un vistazo a ese papel de fotoetiquetado, ¿dijeron cómo la sustitución afectó el rendimiento de proteína? He visto aminoácidos no naturales agregados a través de ARNt mutantes y aaRS, pero los rendimientos suelen ser más bajos.
Gracias por la respuesta. No puedo usar gluteraldehído porque necesito las células vivas. Sí, le he dado un vistazo a los diferentes parámetros ya que necesito el entrecruzamiento bajo condiciones muy específicas. El etiquetado sería costoso y no se garantiza que se integre en mi proteína de interés en la célula, ¡pero esa es una opción interesante! muchas gracias :)

Si la proteína 1 contiene un glutamato cerca del sitio de unión con la proteína 2 y está lo suficientemente cerca de la lisina en la proteína 2, es posible unir el glutamato a la lisina a través del acoplamiento EDC .ingrese la descripción de la imagen aquí

EDC es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, que reacciona con los grupos carboxilo para formar un "éster activo". Este éster es altamente reactivo con aminas primarias, pero también puede reaccionar con agua o iones hidroxilo. Las reacciones generales se describen a continuación:ingrese la descripción de la imagen aquí

El éster activo es el compuesto 2, que probablemente desee hacer reaccionar con la lisina en la proteína 2 para producir la amida en el compuesto 3, con la isourea 4 como subproducto. Esto muestra que son posibles otros productos, dependiendo de lo que golpee primero al éster activo. Esta reacción es más efectiva a un pH de 4 - 5 y produce un enlace de longitud 0, por lo que si tiene que alcanzar los 10 angstroms de ancho, es posible que esto no funcione.

El acoplamiento de EDC a menudo va seguido de la formación de éster de NHS, que es más estable que el éster activo de EDC, pero generalmente se realiza cuando tiene la intención de almacenar el éster activo como un producto seco durante algún tiempo.

Determinación del bioconjugado apropiado
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v