¿Cuál es la mejor manera de expresar dos proteínas en una célula de mamífero?

Tengo dos proteínas y prepararé un vector con ambos genes para una transfección estable. Cada proteína tendrá su propio promotor y usaré el vector piggyBac para insertar un solo casete con ambos genes en los cromosomas. Mis preguntas son:

  1. Si utilizo el mismo promotor (CMV, SV40 o uno inducible) para ambos genes, ¿cómo afectaría esto a los niveles de expresión? Leí en algunos artículos que uno de los genes podría expresarse más bajo que el otro. Si tienes experiencia de primera mano te agradecería que la compartieras.
  2. Si uso el mismo promotor para ambos, pero los coloco lejos (es decir, en los extremos del casete), ¿los niveles de expresión se verán afectados nuevamente? Suena bastante simple, pero creo que la gente habría publicado algo si hubiera tenido un buen resultado con eso.
  3. Si uso diferentes promotores para cada gen (por ejemplo, CMV para uno y Tet-inducible para el otro), ¿cómo funcionaría? No pude encontrar un documento que usara esto y me gustaría continuar con este enfoque; por lo tanto, si tiene alguna experiencia, estaré muy agradecido por cualquier ayuda.

No quiero usar IRES o péptido 2A. Me gustaría poder controlar este experimento en la etapa de transcripción.

Respuestas (2)

Puede utilizar un promotor bidireccional. El problema que mencionaste sobre las proteínas que no se expresan en el mismo nivel ocurre debido a la competencia por la polimerasa. Pero hay partes bien optimizadas y también vectores disponibles comercialmente que funcionan bien.

Puede clonar genes en un orden en serie. No será un problema. Simplemente deje un conector de 100 pb después de la señal poliA del gen anterior. Si su casete se vuelve demasiado grande, la inserción se vuelve un poco difícil. Es por eso que la gente usa IRES o péptidos TA, etc.

Las inserciones basadas en retrovirus funcionan bastante bien, pero no se puede controlar la variación del número de copias entre diferentes células.

Puede utilizar dos promotores diferentes. La dinámica dependerá de la fuerza del promotor y la concentración del inductor.

Gracias por su respuesta. También investigué los promotores bidireccionales, pero decidí probar con dos promotores diferentes. Realmente no quería ir con IRES o 2A porque tengo demasiado miedo de interferir con la interacción, mejor no arriesgarme :). Comenzaré el experimento en breve y compartiré mi experiencia aquí cuando obtenga algunos resultados.

Estaba revisando mis preguntas y me di cuenta de que esto aún no tiene respuesta. Bueno, ahora tengo la respuesta.

Diseñé la construcción con dos promotores separados (CMV para uno y Tet-inducible para el otro) y obtuve muy buenos resultados. No he tenido ninguna dificultad para expresar las proteínas. Pude controlar muy bien la inducible por Tet y obtuve niveles constantes de la otra proteína con CMV.

Para resumir: puede colocar de manera segura dos genes bajo dos promotores separados, preparar líneas celulares estables con ellos y obtener buenos niveles de expresión.

¿Cuál es la mejor manera de expresar dos proteínas en una célula de mamífero?
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v