Tengo un fragmento de inserción que deseo expresar de pUC19 en Escherichia coli. El fragmento de inserción es una subsección de una secuencia de operón más grande y contiene solo los dos últimos cistrones de este operón.
Planeo insertar este fragmento en pUC19 bajo el control de su único promotor lac. Por lo tanto, habrá dos cistrones bajo el control de un solo promotor (lo que, por supuesto, es muy similar a cómo se expresaría en el operón WT).
En mi opinión, la expresión de ambos cistrones bajo el control del único promotor pUC19 lac debería permitir la traducción de ambos genes; una vez que se transcribe el ARNm, ambos cistrones tienen sus respectivos sitios de unión al ribosoma aguas arriba de sus ORF y deben traducirse.
Mi pregunta es, ¿alguien ha tenido alguna vez experiencia expresando fragmentos policistrónicos de plásmidos utilizando un solo promotor para el fragmento completo? No puedo ver ningún problema evidente con esto en teoría, pero pensé en preguntar antes de seguir adelante. En última instancia, prefiero expresar ambos cistrones de un solo plásmido, en lugar de expresar cada cistrón en un plásmido separado.
¡Salud! Izaak
Si entiendo correctamente, está buscando una opción para la expresión policistrónica. ¿Ha considerado usar secuencias T2A o P2A? Estos provienen de virus y esencialmente rompen el polipéptido en dos partes, el llamado péptido T2A autoescindible . El mecanismo real de su trabajo es que el ribosoma se detiene en la secuencia y es incapaz de crear un enlace peptídico, reiniciando efectivamente la traducción con el siguiente aminoácido T2A.
Por supuesto, pierde el control independiente sobre la expresión, ambos productos se expresarán al mismo nivel (pero la degradación puede ser diferente).
Entonces, debería considerar crear una construcción que se vea así:
lac :gen1-T2A-gen2-parada
La cosa es que a) podría no funcionar en E.coli yb) podría no ser necesario, porque el propósito principal de T2A es el mismo nivel de expresión de dos polipéptidos. Y, si sus 2 genes son grandes, para las bacterias es más fácil manejar dos plásmidos separados, en lugar de uno pero mucho más grande.
usuario3473083
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aaaaa dice reincorporar a Monica
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usuario3473083
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