Optogenética - ¿Cómo funcionan las opsinas microbianas?

No hay nada especial en el uso de la rodopsina en comparación con hacer que una célula exprese cualquier transgén. Esta pregunta se puede leer entonces como:

¿Cuál es el proceso en el que una población de células se dirige y se implanta con un gen de interés?

Hay muchas formas, que dependen del tipo de célula en concreto y de si se quiere hacer in vitro , in vivo y en qué especies, y sería muy complejo explicarlas todas detalladamente aquí, así que me limitaré a dos enfoques que son populares cuando se hace optogenética en roedores: infección viral y transgénesis.

La infección viral utiliza un virus inactivado para administrar el transgén. Esencialmente, diseñas una pieza de ADN con el gen de la opsina bacteriana de interés y la colocas en una envoltura viral , que es una serie de proteínas que forman el "cuerpo" del virus y que contienen su material genético.
Luego inyecta el virus en la zona deseada (por ejemplo, en un núcleo cerebral específico) y espera a que infecte las células alrededor del sitio de inyección. Una semana después, esas células expresarán el transgén.

Por (al menos, creo) razones históricas, el primer tipo de virus utilizado para este enfoque fueron los lentivirus. Estos, sin embargo, son un poco más complejos de manejar (especialmente porque requieren salas especializadas donde puedan manejarse de manera segura), por lo que los virus adenoasociados (AAV) son cada vez más populares.

Tenga en cuenta que el virus está inactivo, es decir, no puede replicarse, solo infecta las células alrededor del sitio de infección, pero no podrá propagarse. Esto es tanto por razones de seguridad como porque desea que la infección se limite a la región específica donde inyectó el virus.

Como decía antes, en lugar de poner una opsina bacteriana puedes poner cualquier gen de interés, el procedimiento es el mismo. En cuanto a las opsinas, las dos primeras que se utilizaron fueron la canalrodopsina-2 ( ChR2 ), un canal sensible a la luz azul y que puede usarse para despolarizar (=excitar) las células y la halorrodopsina ( NpHR ), una bomba de cloruro sensible a la luz amarilla que, por el contrario, hiperpolarizará (=inhibirá) las células.
Hoy en día existen decenas de variantes de estas y otras opsinas que se pueden utilizar para impulsar la actividad celular con luces. Muchos de estos se describen en esta revisión (¡cuidado! Bastante técnica):

Optogenética en sistemas neuronales - Yizhar et al., Neuron 2011

En cambio, la transgénesis funciona generando un animal que porta la opsina (o cualquier otro gen) en su ADN. Esto se puede hacer de varias maneras, como por microinyección de células madre embrionarias que portan el transgén.

Puede encontrar una explicación bastante detallada del proceso aquí: Transgenic Cells and Gene Knock-outs , bien resumido en esta figura (tomada de la misma página):

Generación de ratones transgénicos http://9e.devbio.com/images/ch02/wt020302-2.jpg

Pero, ¿cómo se obtiene la selectividad de tipo celular ?
Delante del gen de la opsina también tendrás que poner otra secuencia, llamada promotor. El promotor es una secuencia que es específica de cada gen y que se utiliza para determinar qué genes transcribirá o no una célula. Por ejemplo, el promotor del gen que codifica una proteína solo presente en los músculos será utilizado por las células musculares pero no por las neuronas. Incluso puede ser más específico, por ejemplo, mediante el uso de promotores que son típicos de un subconjunto de células y no de otro (por ejemplo, las neuronas glutamatérgicas usan un conjunto diferente de promotores que las neuronas GABAérgicas, aunque estos dos conjuntos, al menos en parte, se superpondrán) . Sin embargo, esto significa que si desea cambiar el tipo de célula en el que está trabajando, tendrá que cambiar el vector de ADN que está utilizando.
Un enfoque comúnmente utilizado para evitar esto es el uso de vectores dependientes de Cre (tenga en cuenta que esto puede usarse tanto para infecciones virales como para animales transgénicos).
Esencialmente, tendrá una línea de ratón que expresa una proteína derivada del fago P1 , llamada Cre recombinasa , solo en el tipo de célula de interés (nuevamente, usando un promotor específico). Cre tiene la propiedad de cortar el ADN junto a secuencias específicas de 34 pares de bases llamadas loxP (con secuencia ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT). Esencialmente, si tiene loxP-[some sequence in the middle]-loxPy Cre recombinase está cerca, cortará la secuencia en el medio, dejando solo una secuencia loxP.
Cientos de diferentes líneas de ratones que expresan Cre están disponibles comercialmente en la actualidad, para dirigirse a muchos tipos de células diferentes en diferentes órganos.

Ahora, solo necesita una construcción que le permita expresar la opsina de una manera dependiente de Cre. Esto es lo que hizo el grupo de Hongkui Zeng, y se informa en este artículo:
Una caja de herramientas de ratones transgénicos optogenéticos dependientes de Cre para la activación y el silenciamiento inducidos por la luz. -Madisen y col., Nat. Neurosci. 2012

Sin entrar en demasiados detalles, la idea es flanquear una secuencia STOP con dos sitios loxP. Esto bloqueará la transcripción (eso es lo que hace una secuencia STOP) a menos que esté presente la Cre-recombinasa.

Esencialmente:

Fuente : yo mismo, con licencia CC-by-sa , no dude en reutilizarlo

Obsérvese que en el esquema, ROSA26 es un promotor ubicuo, es decir, un promotor utilizado por todas las células, por lo que en este caso la especificidad viene dada por la expresión de la recombinasa Cre y no por el promotor de este constructo. Además, se inserta un indicador fluorescente (por ejemplo, GFP ) para poder visualizar dónde se expresa la opsina.

Al criar estos ratones con la(s) línea(s) Cre de su elección, puede expresar las opsinas en el tipo de célula de su interés.