Estoy intentando expresar GFP en S. cerevisiae usando el promotor GAL1.
Siempre cultivo un cultivo no inducido (en medio SD basado en dextrosa) junto con mi cultivo inducido (en medio SD basado en galactosa). Veo aproximadamente el mismo nivel muy bajo de fluorescencia en ambos cultivos, y también una banda de 27 kD en un gel PAGE. No hay sobreexpresión de GFP, la fluorescencia es muy débil a simple vista y los cultivos no son verdes en luz visible, como los cultivos de E. coli que sobreexpresan GFP.
En el gel PAGE, la cantidad de proteína parece ser la misma tanto en las muestras no inducidas como en las inducidas. Necesito sobreexpresar la proteína, este nivel de expresión con fugas no es aceptable. ¿Cómo hago para arreglarlo? Actualmente estoy cultivando una cultura para hacer una preparación de plásmido para enviar a la secuenciación para asegurarme de que la región promotora del plásmido esté intacta.
Hay un par de cosas que son extrañas aquí. Primero, tienes baja expresión en presencia de galactosa. El promotor GAL1 es realmente fuerte, por lo que me parece extraño. Incluso si tuviera fugas, inducida frente a no inducida debería ser de día y de noche. Sin embargo, debe tener en cuenta que es posible que aún no pueda verlo a simple vista. En segundo lugar, es extraño que tenga fugas en presencia de glucosa (o dextrosa, en su caso). La glucosa no solo debería evitar que el promotor se active, sino que debería reprimirlo.
Algunas soluciones potenciales que vienen a la mente:
1) Consulta el genotipo de tu cepa. Algunas cepas no tienen gal4, el activador transcripcional del promotor GAL1, por lo que si no tiene esto, el sistema no funcionará en su cepa. Asimismo, es posible que no tenga un UAS intacto, lo que haría fracasar la represión. También pueden surgir otros problemas que pueden hacer que una cepa no sea adecuada para este sistema.
2) Secuenciar su promotor/gen. Es un poco doloroso, pero si tiene una mutación en su promotor Gal1, esta podría ser la razón de todos sus problemas. Revisar también los UAS, ya que esto crearía problemas de represión. Finalmente, verifica si el gen en sí está insertado en el lugar que crees que debería estar, si tienes algún percance de recombinación, este puede ser el problema. La aparición de una banda adicional con un peso molecular bajo me hace sospechar que esto puede ser un problema.
3) En esa nota, intente elegir un clon diferente. Tal vez tuviste mala suerte y la colonia que elegiste tenía un defecto, y una colonia diferente será lo que crees que es.
4) Si aún no lo ha hecho, haga reservas frescas de sus medios de galactosa y glucosa. Tal vez tenga impurezas o algún otro problema en sus medios y, por lo tanto, lo que cree que le está dando a las células no es lo que le está dando a las células.
De todos modos, eso es todo lo que tengo. ¡Buena suerte!