¿Cómo caracterizar la estabilidad de una proteína a partir de las curvas de fluorescencia de Trp frente a [desnaturalizante]?

Los documentos que he visto usando este método muestran que es posible calcular la fracción de proteína desnaturalizada analizando el desplazamiento en la longitud de onda de emisión máxima.

¿Has probado a hacer eso con tus datos? ¿Qué obtiene si traza la longitud de onda de emisión máxima en función de la concentración del agente desnaturalizante? Si se ven como curvas sigmoidales (es posible que necesite una escala logarítmica en el eje X) con una meseta superior clara, entonces puede aplicar el método mencionado en estos documentos porque la señal que observa está correlacionada con la fracción de proteína desnaturalizada y saturada ( esta parte es importante: la señal debe saturarse más allá de una cierta concentración de agente desnaturalizante, porque todas las moléculas de proteína están completamente desnaturalizadas y, por lo tanto, agregar más agente desnaturalizante no dará más cambios en la señal; si su señal no se satura, algo está mal) .

Sin embargo, usan proteínas monoméricas con pocos Trp, mientras que yo tengo un dímero con varios Trp.

El estado oligomérico y el número de residuos de Trp no deberían importar, porque la longitud de onda de emisión máxima solo se correlaciona con la fracción de proteína desnaturalizada. La intensidad total aumentará con más residuos de Trp, pero no está utilizando la intensidad como una medida de la fracción de proteína desnaturalizada (y, en todo caso, es bueno tener más intensidad para comenzar dado el efecto de extinción que observa al aumentar la concentración de agente desnaturalizante ).

más alguna variabilidad adicional introducida por los diferentes ligandos.

Para solucionar este problema, necesita dos controles que:

1. probar que ninguno de los ligandos altera la fluorescencia de su proteína,
2. prueba que ninguno de los ligandos emite fluorescencia entre 300 y 450 nm, o si lo hacen entonces necesitas medirlo para poder restarlo de tu espectro total, para así recuperar el aporte proteico a la fluorescencia total.

Para 1, registre los espectros de emisión de fluorescencia de la proteína sin agente desnaturalizante pero en función de la concentración del ligando (abarca unos pocos órdenes de magnitud) y observe si la longitud de onda de emisión máxima cambia con la unión del ligando (podría cambiar, lo que significa que el mismo ensayo puede producir curvas de unión y valores de Kd para sus ligandos, ¡lo que también podría ser útil!). Las curvas de titulación completas de ligandos serían el control más sólido, pero simplemente puede usar las mismas concentraciones de ligandos que se usaron en los experimentos de desnaturalización.

Para 2, el caso más simple sería que sus ligandos no son fluorescentes, pero no puede simplemente asumir eso. Por lo tanto, un control importante que también necesita es registrar los espectros de emisión para cada uno de sus ligandos en las concentraciones utilizadas en los experimentos de desnaturalización, y esto en cada concentración de agente desnaturalizante (o simplemente en la concentración 0 y máxima: si no hay diferencia entre estos dos espectros, no es necesario registrar uno en cada concentración intermedia). Si los ligandos emiten fluorescencia entre 300 y 450 nm, debe restar eso de sus espectros totales para recuperar la fluorescencia que surge solo de la proteína.