¿Cómo diseñar cebadores internos?

Tengo secuencias de la Citocromo c oxidasa I (COI) de varias poblaciones de Peringia ulvae (Mollusca; Gastropoda; Littorinimorpha; Hydrobiidae). Necesito secuencias COI adicionales de una población específica. Cuando uso los mismos cebadores y el mismo protocolo de PCR que para las otras poblaciones, no obtengo ningún producto de PCR para la población específica. Mi IP me sugirió que diseñara cebadores COI internos para Peringia ulvae . ¿Cómo puedo hacer eso? ¿Debo usar las secuencias COI de las otras poblaciones?

Puede intentar simplemente pedir una versión degenerada de los cebadores que tiene. Si es posible, intente alinear las secuencias de muchos alelos COI conocidos de su organismo y vea qué bases en particular son variantes. Si la secuencia se conserva, mantenga esa base, si es variable, agregue un nucleótido degenerado/aleatorio en su orden de cebadores. La combinación de cebadores que obtenga tendrá todas las variantes posibles para una posición determinada, y eso podría ayudarlo a obtener amplificación.
Intente bajar la temperatura de recocido de su PCR. Si hay pocas discrepancias entre las secuencias de ADN de las diferentes poblaciones, es posible que pueda amplificarlas todas con el mismo conjunto de cebadores haciendo que la hibridación sea menos estricta. Una pregunta, ¿los cebadores se hibridan dentro de la secuencia codificante de COI o en la región flanqueante?
@alec_djinn ¿Cómo puedo saber dónde se están recociendo los cebadores?
@JustineVandendorpe, ¿conoces la secuencia de los cebadores? Si es así, simplemente use BLAST para comprender dónde se recocen.
@alec_djinn Conozco las secuencias y ejecuté RÁPIDAMENTE. ¡Muchas gracias!

Respuestas (1)

Si no está obteniendo amplificación, hay varias cosas que visitar antes de querer diseñar cebadores internos. Debe intentar solucionar los problemas de sus reacciones de PCR antes de diseñar y pedir cebadores internos. Si está haciendo mal las PCR, es probable que vuelva a tener los mismos problemas con los cebadores internos.

Hay excelentes guías para solucionar problemas de PCR: solo una búsqueda en Google "Solución de problemas de PCR" debería brindarle mucho material para revisar. Esto es de NEB , pero hay varios otros, cada fabricante tiene el suyo, por lo que podría referirse a uno de cuyos reactivos está utilizando.

Los cebadores generalmente brindan buenas lecturas desde el extremo 5 'durante aproximadamente 600-700 pb y luego la calidad de la llamada de base se deteriora, por lo que si su amplicón objetivo está por encima de 1500 pb más o menos, necesitará cebadores internos porque los cebadores 'externos' darían usted buenas secuencias de sólo 1400 pb o menos (600-700 pb de ambas direcciones, para los cebadores de avance y retroceso). Por lo tanto, los cebadores internos se pueden usar para secuenciar las regiones que no pueden ser alcanzadas por los cebadores directos e inversos principales (externos). Lo más probable es que los artículos publicados en los que esté utilizando los cebadores externos tengan los cebadores internos si el CO1 es lo suficientemente largo como para requerir cebadores internos.

De lo contrario, deberá alinear las secuencias existentes de las otras poblaciones y examinar las regiones de la alineación que se conservan y que podrían actuar como posibles sitios de preparación. Hay otros problemas que deben resolverse antes de que pueda considerar una 'región conservada' como un 'sitio de preparación' y seguir adelante y pedir cartillas. Nuevamente, hay excelentes tutoriales de diseño de imprimaciones disponibles, solo una búsqueda en Google.

Avíseme si alguna parte de la respuesta no está clara o suena como una jerga y haré todo lo posible para simplificarla. Sin embargo, recomendaría encarecidamente solucionar los problemas de la PCR primero, por ejemplo, probar una PCR en gradiente para encontrar la temperatura de hibridación óptima.

Muchas gracias por su respuesta. También estoy usando los reactivos de NEB, así que eché un vistazo a su Calculadora de Tm. Con los parámetros que ingresé, recibí un mensaje de advertencia que decía: "La diferencia de Tm es mayor que el límite recomendado de 5 °C". ¿Sabes cómo puedo solucionar eso?
Hola, ¿cuál es la temperatura de recocido que está utilizando en su PCR y cuál es la Tm para sus cebadores? Además, ¿tiene algo como las lecturas de Nanodrop de sus muestras de ADN? ¿Conoces su concentración? Si las concentraciones son demasiado altas o demasiado bajas, se inhibirán las PCR.
Estoy usando una temperatura de recocido de 52 °C. La Tm sugerida para mis cebadores directo e inverso es de 49 °C y 59 °C, respectivamente. La concentración de ADN de mis muestras oscila entre 0 y 870 ng/µl.
870 es MUY alto. Generalmente se recomiendan 25-100 ng de ADN en la mezcla de reacción.
¿Cómo diseñar cebadores internos?
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