Dada la secuencia: 5'-ACTGACTATGTAGAA………GGCCCTAAGGGCCAA-3' (1)
Desea realizar una PCR de este dsDNA para agregar "proyecciones" en los extremos. En el extremo 5' colocará el sitio de restricción para la enzima NdeI (5'-CATATG). En el extremo 3' colocará el sitio de restricción para MspI (5'-CCGG).
Escriba las secuencias de los cebadores "directo" e "inverso" para hacer esto. Cada cebador debe ser de 16 a 18 nt, con 12 nt para hibridación y 4 a 6 nt para "proyección".
Estoy un poco confundido en cuanto a cómo escribir los cebadores directos e inversos para la secuencia. De los videos he visto que debo escribir el hilo complementario de mi hilo de dar. Cuál podría ser:
3' -TGACTGATACATCTT........CCGGGATTCCCGGTT-5' (2)
Luego, de la secuencia (1) debería obtener el cebador inverso y de la secuencia (2) el cebador directo. Sin embargo, esto no me permite agregar ambas enzimas de restricción porque ambos cebadores estarían de 5' a 3'.
¿O debería simplemente tomar la secuencia dada y escribir los cebadores solo a partir de eso? De modo que los cebadores serían:
Cebador directo: 3'- GGCC TGACTGATACAT
Imprimación inversa: GGATTCCCGGTT GTATAC - 5'
donde las letras en negrita son los sitios de restricción.
¡Gracias!
Como se mencionó en los comentarios anteriores, recuerde que está amplificando el ADN de doble cadena, por lo que se deben generar dos nuevas cadenas complementarias inversas de cada ciclo (para que puedan hibridarse entre sí). Como está escrito en su respuesta, ambos cebadores se hibridarían con su hebra dada y los amplicones no se superpondrían (uno se une en cada extremo, pero ambos se amplificarían en la misma dirección).
Para solucionar esto, necesita un cebador que se una a la secuencia objetivo y otro que se una a la hebra inversa del complemento, que ya ha generado. Los nuevos amplicones se extienden 5' -> 3' (desde el extremo 3' del cebador, no desde la plantilla ), por lo que sus cebadores deben unirse al extremo 3' de su cadena respectiva. Este enlace tiene una buena visualización de eso.
El extremo 3' del cebador debe hibridarse fuertemente con la plantilla, ya que aquí es donde ocurre la extensión (discutida en esta guía ). Por lo tanto, sus secuencias de sitios de restricción flanqueantes siempre estarán en el extremo 5' de cualquiera de los cebadores (observe que la pregunta en realidad sugiere esto al indicar el extremo 5' de cada flanco).
El cebador dado como su cebador "inverso" en realidad se unirá al extremo 3' de su secuencia dada en la orientación adecuada, pero es posible que desee colocar su flanco 3' en el extremo 5' de esa secuencia cebadora, ya que esto será ser teóricamente el extremo 3' de su amplicón. Su otro cebador deberá unirse al extremo 3' de su complemento inverso (que es el extremo 5' de su objetivo), por lo que tendrá el flanco del sitio de restricción 5'.
Por convención, las secuencias de los cebadores siempre se dan en formato 5'---3'. Así que asegúrese de que su respuesta siga esa convención. (es decir, 5'- Flanco -cebador-3').
Si todo esto suena realmente confuso, es porque lo es. Hago esto para ganarme la vida, y aún así siempre reviso dos veces mis cebadores en un programa como Primer3
Maximiliano Prensa
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