Problema de secuenciación de ADN

En primer lugar, permítanme comenzar describiendo el problema:

Su laboratorio ha establecido una técnica para examinar la replicación del ADN en un extracto celular. Al extracto de proteína celular, se le agregan nucleótidos, una pequeña cantidad de 32P-dGTP radiomarcado para facilitar la visualización del ADN sintetizado y una molécula de ADN de doble cadena lineal de 4000 pares de bases que contiene un origen de replicación en el medio. Después de permitir que la reacción prosiga durante 30 minutos a 30 °C, se hierve la mezcla para desnaturalizar las proteínas y las hebras de ADN, se separan los componentes en un gel de acrilamida y se detectan los productos de ADN radiomarcados. Esta reacción completa se muestra en el carril 2 del gel en la figura siguiente.

Problema A:

Realiza el ensayo usted mismo por primera vez sin que nadie más esté en el laboratorio. El tubo etiquetado como "mezcla de nucleótidos" solo tiene suficiente para una sola reacción, pero encuentra un tubo con una etiqueta que dice "dATP, dTTP, dGTP, dCTP" y lo usa en una segunda reacción. Encontrará que la primera reacción se parece al carril 2 y la segunda reacción se parece al carril 3. ¿Por qué no se sintetizó ADN en la segunda reacción?

Mi respuesta:

Porque los trifosfatos de desoxirribosa no tienen un grupo –OH para unirse. Esencialmente no puedes construir con ellos.

Problema B:

Su compañero de laboratorio aisló recientemente una cepa mutante que puede replicar su ADN normalmente a 30 °C pero no exhibe replicación de ADN a 40 °C. Él llama al mutante tsr1, por Replicación sensible a la temperatura. La cepa de tipo salvaje se replica eficientemente a ambas temperaturas. Usted cree que puede usar el ensayo bioquímico de extractos celulares para identificar qué genes son defectuosos en el mutante. Cultiva células de tipo salvaje y células tsr1 a 40 °C, elabora los extractos, incuba la reacción de replicación del ADN a 40 °C y detecta los productos en un gel. Observa el patrón que se muestra en los carriles 4 y 5. Está tan entusiasmado con los resultados que corre a su compañero de laboratorio y le dice que sabe qué enzima es defectuosa. Está encantado con sus resultados, pero dice que hay tres enzimas diferentes que pueden explicar sus resultados. ¿Qué son?

Estoy 100% perdido en esto.

Entiendo por la figura que el tipo salvaje a 40 grados tiene 4000 nucleótidos, por lo que no se corta. El mutante, trs1, se está cortando uno en dos rebanadas de 2000 y una de estas rebanadas se ha cortado en rebanadas de 500. ¿Estoy entendiendo esto correctamente? Tampoco entiendo por qué la línea 500 es tan gruesa en comparación con las demás.

De todos modos, me siento realmente confundido con esto. He estado aprendiendo sobre la secuenciación de Sanger y tiene 100% sentido con ddXTP agregado a la mezcla para ver la duración de cada secuencia y, por lo tanto, poder leer la secuencia, pero ni siquiera estoy seguro de si eso es lo que está sucediendo aquí.