Estoy tratando de encontrar miRNAs que se unan a la 3'UTR de un gen específico. ¿Cuál es la mejor manera de hacerlo (es decir, con un buen análisis de puntaje que los investigadores en esta área usan más comúnmente)? También me gustaría saber los otros métodos posibles si hay varias formas de hacerlo.
Hay algunas herramientas para predecir el enlace:
1 Contexto significa la posición del sitio objetivo en la 3'UTR y la composición de nucleótidos circundante (que también se considera una métrica indirecta de estructura secundaria)
miRanda y TargetScan también tienen clases denominadas objetivos conservados y no conservados. miRanda informa las puntuaciones de miRSVR y TargetScan informa las puntuaciones de contexto, pero estas medidas se basan en pocos resultados experimentales y puedenno siempre ser significativo. miRSVR se basa en el cambio en la expresión del objetivo tras la sobreexpresión/desactivación de miARN. También utiliza métricas para el contexto del sitio de destino. La puntuación de Context+ de TargetScan incluye muchas métricas que incluyen la abundancia y la conservación de los objetivos junto con la puntuación de contexto regular. Algunas de estas métricas pueden ser más útiles que otras. Pero las puntuaciones basadas solo en experimentos de miARN OE/KD pueden ser engañosas, especialmente si la expresión objetivo se cuantifica solo a nivel de ARN. La abundancia de objetivos también varía entre los diferentes tipos de células. Para obtener más detalles sobre estas métricas, consulte los documentos correspondientes a estas herramientas.
Existen algunos procedimientos experimentales para la determinación de dianas que implican principalmente el entrecruzamiento de proteína-ARN seguido de la inmunoprecipitación de Ago y la posterior cuantificación mediante secuenciación de ARN. Ver HITS-CLIP y PAR-CLIP . Estas técnicas realmente no encuentran los objetivos. Todo lo que hacen es correlacionar los niveles de miARN y sus objetivos predichos unidos a Ago (no sabrá exactamente si el complejo ternario ARNm-miARN-Ago realmente se formó o no).
CLASH es una técnica más reciente que intenta abordar este problema mediante la ligadura de ARNm con miARN. De esta manera puedes capturar la interacción miARN-ARNm. Sin embargo, soy un poco escéptico de CLASH; Yo mismo estuve trabajando en este principio hace algún tiempo y enfrenté este desafío. CLASH implica aproximadamente los siguientes pasos:
Mi duda era cómo se ligarían el miRNA y el mRNA cuando la huella de Ago es más grande que un miRNA (reportado ~50-60 nt en HITS-CLIP y PAR-CLIP). Cuando el ARN está protegido por nucleasa, ¿cómo puede ser accesible para la ligasa? Cuando estaba pensando en ello, pensé que era necesaria una degradación parcial de la proteína (después del paso de ARNasa y antes del paso de ligasa) para dar algo de espacio para que actúe la ligasa. Finalmente no trabajé más en ello. Tres años más tarde se publicó el artículo de CLASH y me alegré de que alguien lo hiciera funcionar. Pero el problema de la ligasa no se abordó (¡parece haber funcionado, pero no sé cómo!).
Para probar las predicciones, puede usar un ensayo de reportero (como GFP o Luciferase) con el 3'UTR clonado aguas abajo del reportero. Estos también pueden tener artefactos. Se debe evitar la sobreexpresión del miRNA y se deben realizar mutaciones de semillas para determinar la capacidad de destino.
Otra técnica para determinar un ARNm objetivo es enmascarar su sitio de unión de miARN predicho y ver el efecto en la expresión. Esto se ha hecho en el pez cebra usando morfolinos complementarios a los sitios de destino, pero no en otros modelos AFAIK. Esto me parece un ensayo elegante: sin sobreexpresión y puede determinar con precisión el sitio de destino.
Revisaría minuciosamente la literatura sobre la UTR que le interesa, mucho de esto ya se ha hecho para muchas regiones genómicas desde que comenzó nextgen seq.
En primer lugar, querrá usar algoritmos de predicción computacional para ayudarlo a obtener una buena lista de candidatos de miARN.
La interacción entre un miARN y sus ARNm objetivo generalmente se estudia mediante la cotransfección de un vector de expresión informador que contiene la región 3'-UTR del ARNm y una molécula inhibidora o precursora del miARN.
Pero esto no mide la interacción directa y física entre un miARN y un ARNm específico. Para medir la unión de forma más específica, deberá realizar un ensayo de cambio de electromovilidad.
Aquí hay una herramienta comercial que funcionará bien si solo intenta identificarla.
http://www.activemotif.com/catalog/905/lightswitch-synthetic-mirna-target-reporter-collection
No creo que haya otros métodos muy efectivos/fáciles.
Supongo que podrías hacer algo como hibridarlo, ejecutar el híbrido en un gel, sacar la banda y secuenciarlo.
rhill45
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ecagl
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