miARN se dirige a ARNm

Primero debe definir lo que realmente quiere decir con miRNA-X objetivos mRNA-Y. Si te refieres a la orientación directa, entonces hay ensayos para verificarlo.

Para verificar si el miARN puede potencialmente apuntar al ARNm de forma independiente, lo que se hace de manera rutinaria es un ensayo de regulación a la baja del reportero (generalmente luciferasa). Usted clona la 3'UTR de su ARNm objetivo aguas abajo del gen informador y verifica la actividad de la luciferasa en presencia y ausencia de miARN. Lo hace cotransfectando el miARN y la construcción de luciferasa, recolectando el lisado celular después de un tiempo (generalmente 12/24/36 h después de la transfección) y midiendo la actividad de la luciferasa usando un contador de bioluminiscencia. Esto solo establece la posibilidad molecular de la orientación, pero en realidad no dice si lo mismo sucede realmente en un tejido determinado.

Los ensayos de reportero como este también se pueden modificar para condiciones in vivo. Exprese la construcción reporter-3'UTR en su organismo (o tejido específico). Utilice otro reportero con un sitio de destino mutado en el 3'UTR que suprime la orientación de miARN y compare las actividades de los dos. En el pez cebra, las personas también usan oligonucleótidos de columna vertebral modificados (morfolinos) para enmascarar el sitio objetivo de modo que el miARN ya no pueda dirigirse al ARNm. Este ensayo se denomina ensayo de protección del objetivo .

Existen otros ensayos que no involucran genes informadores pero que en realidad capturan miARN y ARNm unidos al complejo Ago. Esto se hace mediante el entrecruzamiento de proteína-ARN seguido de la inmunoprecipitación de la proteína (Ago) que luego es seguida por la secuenciación del ARN unido. Vea esta publicación para más detalles. Estos ensayos le darán información específica del tejido, pero solo le dirán si un miARN y un ARNm están unidos. No dicen si la actividad del ARNm está regulada negativamente o no.

La orientación del ARNm por miARN, in vivo (que ya se ha establecido mediante ensayos de indicadores ectópicos) depende de muchos factores, el más importante de los cuales son las concentraciones relativas de estas moléculas y los competidores. Para producir un efecto, el miARN debe estar en una concentración suficiente para cada uno de sus objetivos (si el miARN tiene muchos objetivos, la disponibilidad por objetivo disminuirá).

Entonces, si un miARN-X realmente se dirige, es decir, regula a la baja un ARNm-Y en una condición específica, no necesita hacerlo en otra condición. Sin embargo, todavía diríamos que mRNA-Y es un objetivo válido de miRNA-X si lo es en al menos una condición y mejor si ha sido validado usando ensayos de reportero (ectópico).

El mecanismo de direccionamiento del ARNm es altamente específico y depende de varios factores. El complejo diana de ARNm y miARN está altamente conservado incluso desde un punto de vista evolutivo. Hay muchos estudios in vitro que muestran la importancia de la concentración de miARN. Ahora, bajo cualquier tipo de estado de enfermedad, el funcionamiento normal de las células se ve obstaculizado y esto afecta directamente el nivel de transcripción. la tasa puede aumentar o disminuir.

La región diana del ARNm para miARN en la región 3'UTR es muy específica y depende de la complementariedad de pares de bases entre el ARNm y el miARN, por lo que el dúplex miARN-ARNm sigue siendo exclusivo. Hay varios miARN que se han encontrado para un ARNm en particular, si revisa la base de datos TargetHumanScan ( http://www.targetscan.org/ ) encontrará muchos miARN para un ARNm en particular, y viceversa.

La preocupación aquí no es si cualquier ARNm puede ser regulado por el miARN particular, sino si su regulación positiva o negativa es necesaria para la célula en ese estado de enfermedad particular.

Además de lo anterior, vale la pena señalar que el uso de UTR 3' y sitios de poliadenilación puede variar de un tejido a otro, por lo que un ARNm podría tener el sitio de unión de miARN afín en un tejido, pero no en otro.