Extender un pequeño fragmento de ADN

¿Hay alguna manera de extender un pequeño fragmento de ADN, digamos 150 pb, haciendo copias de sí mismo y adjuntando cada copia de ese pequeño fragmento al final de esa secuencia de 150 pb?

Por ejemplo, quiero un fragmento de ADN de 1 kpb+ formado por copias de esa secuencia exacta de 150 pb.

Estoy realizando pruebas ópticas en hebras de ADN, pero el problema es que los fragmentos de ADN a los que me dirijo son demasiado pequeños.

Sin embargo, si el fragmento de ADN es solo una secuencia repetida del fragmento de ADN que estoy analizando, las pruebas arrojarán los mismos resultados. Por esa razón, intento crear una hebra larga de ADN a partir de un solo fragmento de ADN copiado una y otra vez.

¿Hay algún procedimiento que pueda seguir para lograr esto?

bueno, puedes usar PCR junto con alguna técnica de ligadura...
¿Qué estás tratando de hacer exactamente? Si brinda una explicación más clara de su configuración y objetivos experimentales, es posible que podamos ayudarlo más. Tal como está, esta pregunta es bastante vaga.
@MattDMo Hola, básicamente estoy realizando pruebas ópticas en hebras de ADN, pero el problema es que los fragmentos de ADN a los que me dirijo son demasiado pequeños. Sin embargo, si el fragmento de ADN es solo una secuencia repetida del fragmento de ADN que estoy analizando, las pruebas arrojarán los mismos resultados. Por esa razón, estoy tratando de crear una hebra larga de ADN a partir de un solo fragmento de ADN copiado una y otra vez.
Si ambos extremos satisfacen la condición bajo la cual funciona la ligasa, simplemente se trata con ligasa. Pero obtienes productos de ligadura de varias longitudes. Puede cortar de agarosa después de la electroforesis si cree que el rendimiento es suficiente.
¿Podría proporcionar algunos detalles más? ¿Tu fragmento tiene extremos romos? ¿Es importante todo el fragmento o podría cortar un poco si es necesario?

Respuestas (3)

Si lo que intenta obtener es 1kbp de secuencias repetitivas de 150bp, entonces la síntesis como una gran parte podría ser una mejor idea. Cuesta ~150-300$ pero potencialmente ahorrará toneladas de tiempo. (ver gBlock de IDT en EE. UU.)

La PCR y la ligadura con secuencias repetitivas son un dolor de cabeza. Puede ser cierto que ahorre dinero, pero el tiempo y la frustración pueden ser más costosos.

A IDT no le gustan las secuencias muy repetitivas, se vuelven difíciles de controlar la calidad. Sin embargo, depende de su secuencia exacta, así que ponga su secuencia en su forma y vea si vuelve con un problema. Si no, esta es probablemente una buena manera barata de hacerlo. Asegúrese de obtener cebadores de PCR para su secuencia también, para que pueda hacer más.

Dado el costo de la síntesis de ADN, probablemente podría ordenar las dos hebras simples y unirlas. Diseñar dos extremos sobresalientes de enzimas de restricción complementarios en la secuencia. Por ejemplo, en un extremo diseñe un sitio Bam HI parcial y en el otro extremo diseñe un sitio Bgl II . Esos extremos cohesivos se recocerán pero el producto de ligadura resultante no puede ser cortado por ninguna de las enzimas.

Al alternar ciclos de ligadura, digestión y ligadura, puede construir concatémeros de su fragmento inicial. Luego puede purificar en gel las piezas más largas y subclonarlas en un vector adecuadamente preparado.

En lugar de poner adaptadores? (si la orientación no es un problema)
Si la orientación no es un problema, puede usar una enzima despuntadora o una polimerasa de extremos romos durante la PCR (como la polimerasa Phusion) y luego optar por una ligadura de extremos romos. ¡Los cebadores NB deben fosforilarse!

Le sugiero que pruebe la ligadura direccional recursiva . Está destinado a hacer exactamente lo que está buscando, es decir, "polimerizar" ADN cortos en uno más largo. Puede encontrar el protocolo aquí http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bm015630n

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