¿Qué causa los carriles sesgados en un experimento de electroforesis en gel de ADN?

En electroforesis en gel, ¿qué causa efectos como estos (ver columna 11 en el primero y columna 6 en el segundo)?

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(Estas imágenes fueron muestras que tomé de una actividad en línea que hicimos para la clase)

Respuestas (2)

Estos son geles de secuenciación (en los casos aquí, incluso los radiactivos): duran mucho más que los geles de agarosa ordinarios y están hechos de poliacrilamida. Según mi experiencia, la causa más probable de la desviación de los carriles (no solo de las bandas) son las muestras, que todavía contienen demasiadas sales de las reacciones de PCR. Esto también puede sucederle a solo unas pocas bandas, como se ve aquí. En general, estos geles siguen siendo bastante agradables y limpios, he visto mucho peores.

Otras razones que causan geles desiguales son los casos en los que la acrilamida no se mezcla lo suficientemente bien (lo que hace que el gel tenga una concentración diferente y, por lo tanto, provoca diferentes condiciones de funcionamiento), calentamiento desigual (aunque esto generalmente lo impedía el sistema de calentamiento del gel) y geles con fugas donde el campo eléctrico no era completamente uniforme.

¿Podría explicar por qué demasiada sal de PCR puede conducir a esto? ¡Gracias!
Las diferentes concentraciones de sal provocan diferentes condiciones para las corrientes que fluyen a través del gel. Cuando las condiciones no son uniformes, entonces el campo no es uniforme, lo que hace que los ácidos nucleicos transportados no se muevan uniformemente. Podríamos llamarlo una "perturbación en la fuerza" :-)

La sugerencia de @Chris es muy posible, el alto contenido de sal característicamente muestra esto hacia el final del gel. Pero hay sospechosos adicionales. Parece que es solo un gel de agarosa, ¿correcto? He visto algunas cosas que causan esto, incluido que el gel no está nivelado, el gel cambia durante su ejecución, el porcentaje de agarosa no es uniforme y la temperatura aumenta hacia el final. Si lo vuelve a hacer, vigile su amperaje durante la segunda hora más o menos.

Pero primero, intente hacer una limpieza de PCR rápida en una columna (asegúrese de obtener una que no pierda los fragmentos más pequeños) o, alternativamente, una extracción con fenol seguida de una precipitación con ETOH purificará su reacción; y la fuerza estará contigo.