Mis disculpas si mi pregunta es demasiado básica y, por favor, diríjame a un foro más apropiado. Estoy leyendo el libro de texto "Biología celular esencial" de Alberts et al, y también estoy consultando otras fuentes. Estoy leyendo el Capítulo 10 sobre la tecnología del ADN y he leído cómo las enzimas de restricción separan el ADN en hebras de diferentes longitudes. Las hebras de diferentes tamaños pueden luego separarse mediante electroforesis en gel. Creo que entiendo estos conceptos básicos. Mi pregunta es:
¿Todas las hebras de la misma longitud tienen la misma secuencia de pares de bases? No lo creo, y esto sería un problema en el siguiente paso, determinar la secuencia de un fragmento de tamaño usando pares de bases especiales que carecen de un grupo hidroxilo. ¿No es posible que pueda tener dos hebras de 50 pares de bases de largo (por ejemplo) que tengan el mismo comienzo y el mismo final y, por lo tanto, las enzimas de restricción las cortan a una longitud de 50, pero seguramente no son las mismas dentro de su secuencia
El texto dice que una vez que las hebras de diferentes tamaños se separan por electroforesis, puedes cortar una de las bandas y trabajar con eso. Eso tiene sentido si tiene la garantía de tener solo 1 hebra en ese nivel del gel de agar o si las múltiples hebras tienen la misma secuencia exacta.
Si has leído hasta aquí, gracias. Creo que, de manera más general, necesito saber cuántos de estos segmentos se producen cuando usa enzimas de restricción y cuánto dura el promedio. ¿Y hay alguna garantía de que un cromosona (o las 46 cromosonas) tenga todos los segmentos de tamaños únicos (no lo creo)?
E incluso de manera más general :), necesito fuentes adicionales que expliquen la secuenciación del ADN en términos fáciles de entender.
Gracias,
dave
La respuesta a la parte de su pregunta relacionada con las longitudes promedio de los fragmentos de restricción es: si la molécula de ADN que se digiere tiene una secuencia aleatoria y es 50 % GC/50 % AT, entonces la probabilidad de encontrar una secuencia corta dada en cualquier posición es 1/4 N donde N es la longitud de la secuencia corta. Entonces, por ejemplo, para una enzima de restricción con una secuencia de reconocimiento de 4 bases como AluI (AGCT), la probabilidad es 1/256, por lo que la longitud promedio de un fragmento AluI sería de 256 pb. Para una enzima con una secuencia de reconocimiento de 6 bases como HindIII (AAGCTT), el número correspondiente es 4096 pb. Tenga en cuenta que esta es la duración promedio y no es una duración "esperada".
La respuesta a la parte de su pregunta sobre la migración conjunta de fragmentos del mismo tamaño, cómo los purificaría en un gel para un análisis posterior, es más complicada. Creo que lo primero que debe decir es que no haría esto para la secuenciación, y esto se refleja en las diversas respuestas que ya ha recibido: la secuenciación ya no requiere este tipo de enfoque.
Si se vio obligado a tomar esta posición por alguna razón, se me ocurren dos cosas que podrían ayudar: la primera opción sería ejecutar el análisis en un gel de acrilamida cuando puede obtener una resolución mucho mejor de diferentes fragmentos (todos los fragmentos de 50 pb son no es el mismo peso molecular), pero esto realmente solo es útil para fragmentos pequeños (100 pb o menos). Sin embargo, la forma más probable de solucionar el problema de la comigración sería purificar los dos fragmentos que comigran como una mezcla y luego ligarlos en un vector en el que cada recombinante llevaría uno u otro de los dos fragmentos. Esto realmente se remonta a la razón original por la cual la clonación molecular revolucionó las cosas: permite la purificación 'biológica' de fragmentos de ADN seguida de la producción de estos fragmentos en grandes cantidades.
Usted menciona " pares de bases especiales que carecen de un grupo hidroxilo ", por lo que claramente está pensando en términos de secuenciación de Sanger (didesoxi-), en cuyo caso podría clonar directamente en un vector de fago M13 para poder hacer ssDNA para secuenciación directa. Al secuenciar varios clones, encontraría dos secuencias, una para cada fragmento. Sin embargo, aún tendría que encontrar una manera de decidir cuál era el fragmento que realmente le interesaba.
Como digo, las cosas ya no se hacen así.
Tienes razón: las hebras de la misma longitud no necesariamente tienen la misma secuencia. La separación del ADN en la electroforesis en gel se basa puramente en el tamaño hidrodinámico.
La cantidad de fragmentos producidos por la digestión con enzimas de restricción depende de la cantidad de sitios para esa enzima en particular en su ADN de entrada. Las enzimas de restricción solo cortan en secuencias específicas de nucleótidos. No hay una "longitud típica" del fragmento producido por este motivo.
La idea de separar el ADN sobre la base de un digesto de RE es que una mutación que cambia la secuencia donde se une y corta el RE reducirá el número de fragmentos porque el RE ya no puede unirse y cortar en ese sitio: 2 fragmentos más pequeños ahora aparecen como un gran fragmento. Será visible en el gel debido a la diferencia en el número y tamaño de los fragmentos.
Por lo general, cuando ejecuta un gel, está utilizando ADN que se ha amplificado selectivamente para sesgar la lectura a una región particular (conocida) del cromosoma. Este enfoque electroforético funciona porque no estás mirando los 46 cromosomas a la vez.
En lo que respecta a la secuenciación, recomendaría comenzar con Wikipedia . Las técnicas de secuenciación están cambiando con bastante rapidez, por lo que no conozco ninguna buena fuente. Para empezar, puede leer sobre el método de secuenciación de Sanger. Si entiende PCR, entonces no le resultará difícil de entender.
Según tengo entendido, está confundido sobre cómo uno estaría seguro de que una banda en un gel es la secuencia que está buscando, ya que las secuencias pueden ser diferentes y aún tener la misma longitud (por ejemplo, ACTTAT tiene la misma longitud que GGCCGT pero completamente diferente ). Entonces, su pregunta real podría ser algo así como "¿Cómo se asegura uno de que una banda de gel contiene solo la secuencia que uno está buscando?"
Es cierto que, en la práctica, restringir una secuencia larga puede dar lugar a segmentos igualmente largos que no son la misma secuencia. De hecho, es posible cortar un pequeño cuadrado del gel que contiene la banda y luego disolver el gel y extraer el material genético. La secuenciación del resultado le daría uno de dos resultados: 1) Si la banda contenía solo la secuencia deseada, su técnica de secuenciación debería generar exactamente esa secuencia como resultado. 2) Si la banda contenía más de una secuencia diferente de la misma longitud, su método de secuenciación probablemente lo dejará con resultados ambiguos.
Por lo tanto, la secuencia probablemente solo confirmaría si la banda contenía o no una única secuencia distinta. No sería útil como método para separar la secuencia que desea para futuros experimentos de cualquier otra secuencia de la misma longitud. Un método para hacer esto podría ser la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), un procedimiento que produce un gran número (miles de millones) de copias de una secuencia objetivo específica. Si se llevara a cabo una PCR para amplificar la secuencia diana contenida en la banda de gel, cualquier otra secuencia de la misma longitud no produciría ninguna copia. Todavía estarían presentes, pero ser superados en número por la secuencia relevante para sus experimentos debería evitar que las otras secuencias tengan un efecto significativo.
Sin embargo, como señaló dd3, normalmente no ejecutaría el resultado de una restricción en un gel y luego intentaría separar su secuencia objetivo del resto. Más bien, simplemente usaría el método de PCR descrito anteriormente directamente después de usar las enzimas de restricción y luego ejecutaría el resultado en un gel. Entonces obtendrías una banda muy fuerte para la secuencia que estabas buscando y bandas mucho más débiles para todo lo demás.
dave
dave
pitido
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