¿El etanol destruye la ARNasa?

He recibido consejos contradictorios sobre esto: algunas personas creen que se puede eliminar la contaminación por ARNasa simplemente rociando el banco, las pipetas, los guantes, etc. con etanol. Otros piensan que el etanol no destruye la RNasa y que se necesitan reactivos especiales para evitar la contaminación por RNasa.

Entonces, ¿el etanol elimina la contaminación por ARNasa? Si no, ¿qué reactivo hace?

Vea la respuesta de shigeta a continuación: la "inhibición" no es realmente la forma correcta de pensar en esto, ya que puede implicar una interacción específica cuando se habla de una enzima.
Buen punto, cambié la redacción de la pregunta para transmitir la necesidad de una desnaturalización permanente.

Respuestas (2)

Creo que los protocolos para limpiar la cristalería no se arriesgan y solo se preocupan por la degradación del ARN en lugar de centrarse en una clase de enzimas.

Se supone que EtOH desnaturaliza la ARNasa y cualquier otra proteína en la superficie.

Otros productos químicos, como el dietilpirocarbonato (DEPC), que se utilizan para lavar la cristalería, eliminan toda la actividad bioquímica al reaccionar con los restos nucleofílicos de la proteína (-OH, -SH -NH( 2/3 ) ) . (Vea los comentarios a continuación para obtener más información).

Estos tratamientos van seguidos de calentamiento a 300-450 F durante 2-4 horas. Esta no es una descontaminación específica de ARNasa: se elimina toda la actividad biológica.

La actividad de ARNasa no se evalúa mediante la detección específica de una enzima en particular, sino que se juzga por la degradación de una muestra de ARN en el entorno de laboratorio. Por lo tanto, la inhibición específica no vale la pena: cualquier proteína que pueda interactuar con el ARN y degradarlo se denomina ARNasa en estos protocolos.

En resumen, la contaminación y la degradación del ARN son muy fáciles en un entorno de laboratorio. Tenemos un banco de trabajo dedicado solo al ARN en nuestro laboratorio que se trata con una solución degradante de ARNasa de "amplio espectro" antes de realizar cualquier trabajo de ARN.
El tratamiento térmico se denomina despirogenización y no solo elimina por completo toda la actividad biológica, sino que también destruye los pirógenos (inductores de fiebre) como el LPS o la endotoxina.
Gracias por agregar a esto chicos. Creo que puedes ver cómo los reactivos realmente limpian el vidrio. Estoy familiarizado con los protocolos, pero yo mismo no he trabajado con ARN.

No desea solo inhibir o desnaturalizar temporalmente las ARN, si trabaja con ARN, debe inactivar permanentemente las ARN. Trabajo con ARN, y no he visto a nadie usar etanol para eliminar las ARNasas, no confiaría en que funcione de manera confiable. Las ARNasas son enzimas realmente estables, incluso sobreviven al autoclave en alguna parte, por lo que no me sorprendería si pueden replegarse después de la exposición al etanol.

Los métodos habituales para eliminar las ARNasas son

  • Tratamiento con DEPC al 0,1 % (calentar hasta al menos 60 °C, o esterilizar en autoclave si es posible para eliminar el DEPC residual más adelante). No se puede utilizar, por ejemplo, con el tampón Tris o cualquier otra cosa que reaccione con él. DEPC es cancerígeno, por lo que debe seguir los procedimientos de seguridad adecuados.
  • Cualquier cosa hecha de metal o vidrio, calentar hasta 250 °C durante unas 2 horas
  • NaOH 1 M durante al menos 30 minutos (debe lavarse bien para eliminar el NaOH)

Debe tener en cuenta que cualquier cosa que destruya las ARN probablemente hará lo mismo con su ARN.

La esterilización en autoclave no protege completamente contra las ARNasas, pero aun así reduce significativamente la actividad de las ARNasas . Entonces, si bien no debe confiar en el autoclave para deshacerse de las ARNasas, en mi experiencia es suficiente si comienza desde una fuente que es poco probable que contenga una gran cantidad de ARNasas. Las puntas de pipeta (no las puntas sueltas de una bolsa, para minimizar la manipulación) y el agua filtrada por millipore son bastante seguras después de esterilizarse en autoclave.

También hay inhibidores comerciales de ARNasa, pero solo los he usado en casos en los que tuve que mezclar ARN y proteína, y la proteína no estaba completamente libre de ARNasa.

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