¿Cuáles son las posibles razones para obtener una banda adicional no reconocida en la electroforesis en gel de agarosa?

Realicé una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % de mi muestra de ADN plasmídico que consiste en el vector GFP, utilizando las enzimas de restricción NheI y HindIII.
Se utilizaron dos tipos de plásmidos, es decir, aislados por el método miniprep-alkali, y otro aislado por el sistema midi prep (puro) de la misma fuente E. coli .
Las líneas 4 y 5 muestran plásmidos cortados y sin cortar, respectivamente, aislados por el sistema midi prep.
Las líneas 1, 2 y 3 muestran el marcador de 500 pb, cortado y sin cortar de la señal del plásmido aislado miniprep, respectivamente. ingrese la descripción de la imagen aquíEn la imagen adjunta, encontramos una banda adicional en los plásmidos aislados por el método alcalino (líneas 2 y 3), pero en las muestras puras (líneas 4 y 5) no se encontraron tales bandas adicionales.
¿Cuáles son las posibles razones detrás del resultado? ¿Cómo puedo interpretar este resultado? Si alguien ha experimentado resultados similares, por favor comparta.

No estoy seguro de qué es, pero también noté esto hoy en un gel. Solo estaba presente en plásmidos (digeridos) que se cultivaron en DH5alfa (y ausente en XL1 azul). Aunque podría ser una coincidencia.

Respuestas (2)

A mí me parece contaminación de ADN genómico.

Más importante aún, ¿realmente importa? Ciertamente aprecio la curiosidad pero, si su objetivo es la clonación, continuaría y luego haría algunos cortes de diagnóstico de su plásmido después de la transformación. Puede ver claramente su vector o insertarlo en el gel.

@SanjuktaGhosh En lugar de responder como comentario, ¿tal vez es mejor escribir directamente la respuesta? Además, no parece una pista breve sino una respuesta realmente pequeña porque parece que no quedan muchas cosas por elaborar o citar.
Si se tratara de contaminación por gDNA, esperaría ver muchas más bandas...
@JoeHealey Yo también lo haría pero, para mí, es la explicación más plausible para un fragmento tan grande.
Especialmente dado que está ausente en las llamadas fracciones "puras", que presumiblemente son más limpias.

Podrían ser varias cosas... justo en la parte superior de mi cabeza. Sin su mapa vectorial y los tamaños esperados, será casi imposible decirlo con seguridad.

Probablemente también tendrá que darnos más información sobre sus condiciones de incubación, etc.

  1. La cultura original de la que te preparaste podría no ser tan homogénea como crees:
    • Terminaste con un mutante (quizás en tu sitio de restricción en ese clon en particular)
    • Su cultivo original está contaminado, quizás con una segunda E. coli con un plásmido diferente.

Esto probablemente sea poco probable, suponiendo que su técnica molecular/microbiológica sea decente, pero sucede de vez en cuando.

  1. Digestión incompleta. Es posible que algo en el eluato de su primer método de extracción haya inhibido sus enzimas, eso no está sucediendo en el otro mecanismo de extracción, o no dejó el resumen durante el tiempo suficiente.

  2. Te perdiste algo de la mezcla de reacción para una de las muestras (por lo general, me culpo a mí mismo primero cuando las cosas van mal, ¡así que generalmente lo repito para estar seguro!)

¿Cómo una digestión incompleta da lugar a un tamaño molecular mucho mayor que el plásmido completo (pista 4 y 5)?
El plásmido sin cortar puede ejecutarse en todo tipo de longitudes. Si está superenrollado, correrá más de lo que 'debería' para su tamaño. Si es circular pero no superenrollado, funcionará más lento de lo que "debería" en comparación con si fuera un solo fragmento lineal, ya que no se mueve fácilmente a través del gel.
¿Cuáles son las posibles razones para obtener una banda adicional no reconocida en la electroforesis en gel de agarosa?
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