¿Cuántas bandas de gel de agarosa son típicas para el ADN circularizado?

Soy consciente de que el ADN circular puede estar tanto relajado como súper enrollado. Sin embargo, cuando ejecuto un gel de agarosa del plásmido circular junto con el plásmido digerido individualmente con BamHI y HindIII, veo 1 banda para el plásmido linealizado (carriles 2-5) (como se esperaba) pero 5 bandas para el plásmido circular (carriles 6 y 7 ).

¿Cuáles son estas diversas conformaciones?

Gel de agarosa al 1%, 1 y 2 indican plásmido preparado a partir de 2 colonias y son esencialmente réplicas.  Ambos plásmidos de 1 y 2 se digirieron individualmente con BamHI y HindIII (disculpas por la etiqueta incorrecta "BamH"

Respuestas (3)

No lo tengo en mis manos, pero no me sorprendería si el ADN superenrollado migra a diferentes distancias según alguna conformación topológica interna (es decir, más o menos enrollado Y/O más o menos mellado). Del mismo modo, esta imagen destaca >8 conformaciones. Lo que se ejecuta en el gel es ADN de fago circularizado con algún grado de anudado debido a la circularización (el ADN de fago es por lo demás lineal).

movilidad del ADN anudado en electroforesis en gel

Figura de: Arsuaga et al. 2005, PNAS 102 (26) 9165-9169 ( gratis en PubMed Central )

Otra posibilidad teórica es que se cultivaron dos o más plásmidos de diferentes tamaños en el mismo maxiprep debido a alguna contaminación. Pero en este caso, el problema lo detectarás también en la digestión, por lo que no parece ser tu caso.

Gianpaolo tiene razón en que estás viendo las diferentes conformaciones del ADN circular.

El crecimiento de plásmidos en bacterias produce 3 formas principales: relajado, enrollado y súper enrollado.

  • Relajado tiende a correr un poco más alto que el tamaño esperado porque no puede viajar tan eficientemente a través de la agarasa;
  • Enrollado migra un poco más lejos del tamaño esperado porque es un poco más compacto y por lo tanto migra más fácilmente;
  • Super-enrollado, el más compacto, migra mucho más lejos del tamaño esperado.

Concluiría de tu imagen lo siguiente:

  1. Que los cortes de HindIII son eficientes y han linealizado casi todo su plásmido.
  2. BamHI está cortando, pero no tan eficientemente como HindIII durante (presumiblemente) la misma cantidad de tiempo. Esto debería digerirse por más tiempo si es realmente importante digerir solo con BamHI, pero para fines de diagnóstico, está bien. Digo esto debido a las bandas débiles que se ven en ~4.5 y ~3.7 kb, que probablemente sean su ADN plasmídico enrollado y súper enrollado, respectivamente.
  3. De sus resúmenes lineales, el plásmido es de 6 kb.
  4. Al observar el plásmido de control no digerido, su método de mini preparación no está limpio y parece estar contaminado, posiblemente por ADN genómico. Además, ve indicios de rayas en los carriles de resumen individuales. ¿Se hizo esto usando trizol?
  5. Esperaría que la banda de 10 kb sea posiblemente la forma relajada del plásmido, con gran parte del ADN del plásmido existente en una conformación superenrollada.

Si estas son muestras importantes, consideraría purificarlas usando métodos más limpios, por ejemplo usando una columna.

Creo que todas estas respuestas han pasado por alto la explicación más probable de las múltiples bandas en la muestra sin cortes. Estoy de acuerdo en que es probable que vea círculos superenrollados, lineales y relajados (abiertos) en ese orden subiendo por el gel. Pero luego, todas esas formas superiores son lo mismo que se repite para los dímeros, trímeros, etc. formados por recombinación entre moléculas de plásmidos. Entonces, por ejemplo, creo que la banda de 10 kb en los carriles sin cortar es un dímero superenrollado. Tengo un vago recuerdo de que se ven más de este tipo de cosas si el ADN se prepara a partir de una cepa recA de E. coli .

actualización Aquí hay alguien que creo que estaría de acuerdo.