Me preguntaba cuántos pares de bases se secuencian normalmente con los métodos illumina de ARNm/ADNc aguas arriba del sitio de poliedenlación. Gracias.
Podrían alcanzarse 50-75 pb.
Referencia a la Guía v2 de preparación de muestras de ARN de TruSeq®. Mi laboratorio usó cebadores aleatorios y las longitudes de lectura fueron un promedio de 75 pb de longitud para un proyecto de secuenciación de ARN. Pero el control de la distancia desde polyA no se consideró en nuestro proyecto.
Usando cebadores oglio(dT), podría intentar controlar una longitud específica de la cola poliA. Dos variaciones básicas usan cebadores aleatorios o cebadores oligo(dT) para esta reacción. Los cebadores Oligo(dT) están altamente sesgados en 3' y en su mayoría son adecuados para el análisis de abundancia (expresión) de ARNm. Los cebadores aleatorios también dan como resultado cierto sesgo, que puede reducirse mediante la fragmentación del ARN de entrada.
Fuente: Colección de métodos de secuenciación de ARN - Illumina, página 8.
También se pueden lograr diferentes longitudes para diferentes necesidades. Expresión génica/perfilado de ARN: la cuantificación del transcriptoma de codificación generalmente requiere una sola lectura corta (a menudo de 50 a 75 pb) para minimizar la lectura a través de las uniones de empalme mientras se cuentan todos los ARN en el grupo.
Análisis del transcriptoma: los nuevos proyectos de ensamblaje y anotación de transcriptomas tienden a beneficiarse de lecturas de extremos emparejados más largas (como 2 x 75 pb) para permitir una cobertura más completa de las transcripciones y la identificación de nuevas variantes o sitios de empalme. Se requieren lecturas de extremos emparejados para obtener información de los extremos 5' y 3' de las especies de ARN con kits de preparación de bibliotecas Stranded RNA-Seq.
Análisis de ARN pequeño: debido a la corta longitud del ARN pequeño, una sola lectura (generalmente una lectura de 50 pb) generalmente cubre la secuencia completa. Una longitud de lectura de 50 pb secuencia la mayoría de los ARN pequeños, además de suficiente adaptador para identificarlo con precisión y recortarlo durante el análisis de datos.
Fuente: Illumina (Consideraciones para la longitud y cobertura de lectura de RNA-Seq)
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