Extracción de ADN libre de células

Para tener en cuenta: no tengo experiencia personal con este protocolo. Reenvío este documento, que me pasó un colega

Hay muchos kits y métodos disponibles que no dependen de Qiagen. O, alternativamente, si les preguntas amablemente, hacen grandes descuentos en su primer kit que les compras como una especie de prueba (ya que no hacen muestras).

Sin embargo, para responder a su pregunta principal, ¿está agregando un detergente y desnaturalizando por calor sus muestras antes que el fenol-cloroformo (Tritón/Calor/Fenol)?

Las muestras de sangre para el análisis de CFDNA se recogen en tubos con EDTA y se mantienen a temperatura ambiente o por debajo de ella (18 °C–22 °C) durante no más de 2 h antes de la separación del plasma. El plasma debe separarse de las muestras de sangre total mediante doble centrifugación (800 g y 1600 g durante 10 min, por separado), evitando la lisis de los leucocitos. Preferimos aislar CFDNA inmediatamente después de la separación del plasma para minimizar el efecto del almacenamiento prolongado. De lo contrario, las muestras deben dividirse en alícuotas en porciones pequeñas y almacenarse a -70 °C antes de la extracción, ya que la fragmentación de CFDNA puede deberse a ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Para el método THP, se mezclaron 500 μl de plasma/suero con 5 μl de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Reino Unido) y se desnaturalizó con calor a 98 °C durante 5 min. Las muestras se colocaron en hielo durante 5 min, luego se extrajeron con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1, v:v:v) (Sigma-Aldrich, Reino Unido) y se centrifugaron durante 10 min a 14 000 g. . La fase acuosa se precipitó durante la noche con 1/10 de volumen de NaOAc 3 M y 2,5 volúmenes de etanol al 100 % a -20 °C. El sedimento de ADN se lavó con etanol, se secó al aire y se resuspendió en 50 μl de ddH2O.

En el protocolo THP, se utilizó una incubación a 98 °C para inactivar los inhibidores de la PCR y desnaturalizar las proteínas en las muestras de plasma/suero. Se probaron diferentes tiempos y temperaturas antes de elegir este. Dado que habíamos notado una contaminación sustancial de ADN en SDS, se usó Triton X-100 en el paso de solubilización de proteínas. La PCR convencional directa se realizó con éxito en muestras desnaturalizadas por calor y pudo detectar 25 ng/ml de ADN, lo que indica que este procedimiento simple ofreció suficiente digestión de proteínas y eliminación de inhibidores para el análisis de PCR. El protocolo THP proporcionó un rendimiento significativamente mayor de solución de ADN puro para el análisis de qPCR que el kit QIAamp. El protocolo THP mostró una alta eficiencia incluso con pequeños fragmentos de ADN tan bajos como 100 pb.

Es posible que desee leer esto: Xue, Xiaoyan, et al. "Optimización del rendimiento y la utilidad del ADN circulante libre de células del plasma y el suero". Clínica Química Acta 404.2 (2009): 100-104.

Una búsqueda rápida en Google Scholar también reveló algunos otros documentos que podrían interesarle:

Fleischhacker, Michael, et al. "Los métodos para el aislamiento de ADN plasmático libre de células afectan fuertemente el rendimiento de ADN". Clínica Química Acta 412.23 (2011): 2085-2088.

ACTUALIZAR:

Después de leer esto ( Fong, Siew Lee, et al. "Comparación de 7 métodos para extraer ADN libre de células de muestras de suero de pacientes con cáncer colorrectal". Química clínica 55.3 (2009): 587-589. ) que proporciona alrededor de 7 protocolos ( lamentablemente sin ninguna referencia por alguna razón) Fui a buscar y se me ocurrió esto:

El ADN se extrajo de 1,0 ml de plasma mediante el método de fenol-cloroformo con ligeras modificaciones. Se trató un ml de plasma con una solución de SDS/proteinasa K 1x (0,5 mg/ml) (1:1), se incubó durante la noche a 56 °C seguido de tratamiento con fenol-cloroformo (4:1) y se centrifugó a 7 000 rpm. La capa superior se transfirió a tubos de centrífuga nuevos de 15 ml y se repitió el mismo paso nuevamente; El ADN se precipitó añadiendo glucógeno (0,1 µg/µl), acetato de amonio (7,5 M) y alcohol absoluto. El sedimento de ADN se obtuvo por centrifugación a 7 000 rpm; se lavó con alcohol al 70% a 10 000 rpm, se secó y finalmente se disolvió en tampón TE a 56 °C y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

Puede leer sobre el método anterior aquí: Singh, Deepika Misra1 Renu y Monisha Banerjee. "Un método simple y confiable para obtener ADN fetal de la circulación materna; su precisión y sensibilidad".

Además, si está disponible para usted, podría valer la pena:

Gahan, Peter B., ed. Ácidos nucleicos circulantes en el diagnóstico precoz, pronóstico y seguimiento del tratamiento: una introducción. vol. 5. Primavera, 2014.