Estoy tratando de entender cómo funciona exactamente el paso de unión al gel de sílice (en kits) y no puedo encontrar ningún documento que brinde una explicación de la física o la química; especialmente en la forma en que funciona la guanidina-HCl.
Así que vamos a obtenerlos desde el principio.
En primer lugar, ajustamos las condiciones de unión al ADN añadiendo un tampón que incluye guanidina-HCl y etanol y luego centrifugamos nuestra muestra. Sabía que la guanidina-HCl destruye la estructura terciaria de las proteínas, pero en alguna parte leí que también ayuda al ADN a unirse a una columna de sílice. Busqué para encontrar la forma en que funciona, pero no pude encontrar un documento. Además, ¿cuál es el papel del etanol en este paso? ¿Es solo para eliminar proteínas y polisacáridos de la muestra?
La guanidina HCL es una sal caotrópica . Las sales caotrópicas son fundamentales para la lisis celular y la unión a la resina de sílice. Específicamente, los caótropos tienen dos funciones importantes en la extracción de ácidos nucleicos.
Desestabiliza los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrofóbicas.
Conduce a la desestabilización de las proteínas (incluidas las nucleasas).
La estructura y función macromoleculares dependen del efecto neto de estas fuerzas (ver plegamiento de proteínas), por lo tanto, se deduce que un aumento en los solutos caotrópicos en un sistema biológico desnaturalizará las macromoléculas, reducirá la actividad enzimática e inducirá estrés en una célula (es decir, una célula tendrá que sintetizar protectores contra el estrés). El plegamiento de la proteína terciaria depende de las fuerzas hidrofóbicas de los aminoácidos a lo largo de la secuencia de la proteína. Los solutos caotrópicos disminuyen el efecto hidrofóbico neto de las regiones hidrofóbicas debido a un desorden de las moléculas de agua adyacentes a la proteína. Esto solubiliza la región hidrofóbica en la solución, desnaturalizando así la proteína. Esto también es directamente aplicable a la región hidrófoba en las bicapas lipídicas; si se alcanza una concentración crítica de un soluto caotrópico (en la región hidrófoba de la bicapa), la integridad de la membrana se verá comprometida y la célula se lisará. [Fuente ]
Interrumpir la asociación de ácidos nucleicos con agua.
Proporcionando así las condiciones óptimas para su transferencia a sílice.
Las sales pueden tener propiedades caotrópicas al proteger las cargas y evitar la estabilización de los puentes salinos. Los enlaces de hidrógeno son más fuertes en medios no polares, por lo que las sales, que aumentan la polaridad química del disolvente, también pueden desestabilizar los enlaces de hidrógeno. Mecánicamente, esto se debe a que no hay suficientes moléculas de agua para disolver los iones de manera efectiva. Esto puede resultar en interacciones ion-dipolo entre las sales y las especies de enlaces de hidrógeno que son más favorables que los enlaces de hidrógeno normales. [ Fuente ]
El etanol, como la guanidina HCL, es un agente caotópico . El etanol se agrega por 2 razones:
Enhance and influence the binding of nucleic acids to the silica.
Interfere with non-covalent intramolecular forces as outlined above.
Reduce association of nucleic acids with water. From Melzak et al. (1996):
Decreaing the water activity in solution through addition of either a chaotropic salt or an alcohol changes the helical structureof B-DNA either continuously to C-DNA or through a sharp cooperative transition to A-DNA (28). Either transition is accompanied by a decrease in solvent-accessible surface area.
The correct concentration allows for washing of the salts from the membrane. [Source].
Citations
alan boyd
FN
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Luigi