Ensayo de enzima pectinasa

Estoy trabajando en el ensayo de la enzima pectinasa. Incubé 900 ul de sustrato durante 10 minutos en el baño de agua, luego agregué 2 ml de reactivo DNSA, luego añadí 100 ul de extracto de enzima y finalmente leí la absorbancia a 540 OD. Sin embargo, los valores son altos. ¿Cómo puedo solucionar los valores altos de blanco de enzima en el ensayo de pectinasa?

Entonces, ¿tiene el problema de que su espacio en blanco es demasiado alto?
Sí, la enzima en blanco es alta
¿Puedes excluir tener una contaminación?
¿Qué contaminantes? En la medida de lo posible, la producción de enzimas se realiza en un entorno libre de contaminación.
No estarás haciendo este ensayo en tu mano, ¿verdad? Entonces, ¿qué pasa con los tubos de reacción, la cubeta del fotómetro, etc.?
Los tubos de reacción y la cubeta están limpios.
Diluya los estándares para que los valores estén en el rango lineal y dentro del rango de alta precisión del espectrofotómetro
Diluí el sustrato estándar al 0,5% p/v, pero aún así los blancos de enzima son de alto valor,
¿Cuál es el sustrato?
pectina (cítricos)
¿El blanco de enzima está turbio/turbio?
Sí lo es, hay un cambio de color a marrón claro.
Si el blanco está turbio o coloreado, debe usarlo para calibrar/poner a cero el instrumento (en lugar de usar agua o tampón). ¿Es eso lo que estás haciendo?
Estoy usando el blanco de reactivo/sustrato para calibrar el instrumento

Respuestas (1)

Entonces, ¿su blanco es todo menos la enzima? Es decir, sustrato y DNSA con 100 uL de agua? En caso afirmativo, mida, como controles negativos, sustrato solo y DNSA solo. Si uno de ellos también absorbe mucho la luz, puede estar contaminado y se debe solicitar un vial nuevo. Si ambos son altamente absorbentes, puede ser el agua que está usando o el espectrofotómetro.

Alternativamente, puede intentar medir un curso de tiempo. Si la absorbancia del blanco aumenta a medida que pasa el tiempo, hay contaminación y puede serle útil volver a pedir los reactivos. Si la absorbancia se mantiene constante, no se trata de una contaminación enzimática, es decir, el culpable es el agua en mal estado, la especificación rota o incluso un protocolo incorrecto. (Es decir, reordenar o repetir no ayudará).

Ensayo de enzima pectinasa
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v