Diferencia entre los métodos LIGR-seq y PARIS

LIGR-seq

LIGR-seq (Figura 1A) emplea el entrecruzamiento in vivo de dúplex de ARN utilizando el derivado de psoraleno modificado 4′-aminometiltrioxaleno (AMT), que se intercala en dúplex de ARN y, tras la irradiación UV de 365 nm, genera aductos entre hebras entre bases de pirimidina yuxtapuestas ( Calvet y Pederson, 1979). Después de la lisis celular y una digestión limitada con endonucleasa S1 monocatenaria, los salientes de ARN libres adyacentes a los dúplex se ligan usando ligasa de ARN circ. Esta ligasa cataliza la ligadura dependiente de ATP de los extremos proximales del ARN y tiene una actividad óptima a temperaturas elevadas que reducen la hibridación del ARN. La RNasa R, una exoribonucleasa 3′→5′ que digiere los ARN lineales y estructurados (Vincent y Deutscher, 2006), se usa luego para digerir el ARN no entrecruzado, enriqueciendo así los dúplex entrecruzados con AMT (Figuras 1A y S1). Después de la inversión de los entrecruzamientos mediante irradiación de 254 nm, las muestras de ARN se someten a secuenciación de alto rendimiento para detectar quimeras formadas por ligación. Para evaluar los artefactos de ligación de fondo, se preparan muestras no reticuladas ("–AMT") en paralelo y se utilizan muestras no ligadas para determinar la expresión relativa de transcritos que forman quimeras para la normalización y el análisis posteriores.

Resumido

Entrecruzamiento AMT ⟶ Lisis celular ⟶ Digestión con endonucleasa S1 ⟶ Ligadura ARN-ARN con ligasa circRNA ⟶ Digestión con RNasa R de ARN no entrecruzado ⟶ Reversión de entrecruzamiento ⟶ Preparación de bibliotecas de secuenciación (ligación de adaptadores, transcripción inversa, etc. )

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PARÍS

Las células HeLa, HEK293T y mES se trataron con o sin AMT y se entrecruzaron con UV de 365 nm. Los lisados ​​celulares se digirieron con nucleasa S1 y el ARN se purificó usando TRIzol. El ARN purificado se digirió adicionalmente con ShortCut RNase III en fragmentos más pequeños. El ARN se separó mediante gel de poliacrilamida nativa al 12 % y, a continuación, los cortes de gel de primera dimensión se sometieron a electroforesis adicional en un gel desnaturalizado con urea al 20 % de segunda dimensión. El ARN entrecruzado por encima de la diagonal principal se eluyó, se ligó por proximidad con ARN ligasa I de T4 y se sometió a fotoinversión con UV de 254 nm. A continuación, las moléculas de ARN ligadas por proximidad se ligaron a adaptadores con código de barras y se convirtieron en bibliotecas para la secuenciación de Illumina.

Resumido

Entrecruzamiento AMT ⟶ Lisis celular ⟶ Digestión con endonucleasa S1 ⟶ Purificación con TRIzol ⟶ Digestión con RNasa III ShortCut ⟶ Purificación en gel 2D ⟶ Ligadura de ARN-ARN con ARN ligasa 1 de T4 ⟶ Reversión de entrecruzamiento ⟶ Preparación de bibliotecas de secuenciación (ligación de adaptadores, transcripción inversa, etc. )

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Con respecto a la captura de interacciones ARN-ARN, estos métodos son esencialmente los mismos. Dado que ambos artículos se publicaron en las revistas de Cell Press en la misma semana, es probable que se desarrollaran al mismo tiempo en laboratorios de la competencia. Puede darse el caso de que los editores hayan coordinado la publicación para que ninguno de los dos grupos se sintiera "ganado".

Por lo que puedo decir, la principal diferencia está en cómo los métodos distinguen a los interactuantes de ARN in vivo de los eventos transitorios de hibridación de ARN-ARN que ocurren durante el transcurso de los protocolos. En LIGR-seq, incluyen un control no reticulado ("–AMT") para que puedan diferenciar las verdaderas interacciones del ruido de fondo al buscar quimeras de ligación que se enriquecen en las muestras +AMT en relación con –AMT. En PARIS, la segunda dimensión del gel 2D es urea al 20 %, que serviría para desnaturalizar cualquier molécula de dsRNA no reticulada antes de la ligadura; ver los métodos completos para más detalles:

Se incrustaron rebanadas de gel de cada carril y se polimerizaron en la parte superior del gel de poliacrilamida desnaturalizada con 20 % de urea-TBE de segunda dimensión... El gel de segunda dimensión tiene una temperatura más alta debido a la alta potencia, y la alta temperatura facilita la desnaturalización de los fragmentos de dsRNA .

También puede haber una diferencia en las distribuciones de longitud de las moléculas de ARN quimérico obtenidas al final de cada método, ya que LIGR-seq y PARIS usan diferentes enzimas RNasa con diferentes parámetros de digestión.