Cuantificación de ADN en un laboratorio biológico de secundaria

Dentro de un rango lineal, la intensidad de las bandas de ADN teñidas en un gel es directamente proporcional a su masa. Al hacer una curva estándar a partir de bandas de masa conocida, se puede estimar la masa de las bandas desconocidas. Este proceso se llama densitometría . Escribí brevemente sobre su uso en la cuantificación de bandas de proteínas después de SDS-PAGE en esta respuesta , pero entraré en más detalles sobre cómo se hace usando el siguiente gel teñido con bromuro de etidio:

A la derecha hay un marcador de peso molecular (digerido BstEII de ADN λ) con bandas de masa conocida. A la izquierda hay dos bandas de masa desconocida (en realidad, un plásmido de doble corte).

Uso un programa gratuito llamado ImageJ para estimar las intensidades de las bandas. Tienen un tutorial sobre cómo medir la intensidad de la banda aquí . También puede obtener ImageJ empaquetado con Java (y muchas otras cosas) en el software Fiji .

Abra la imagen en ImageJ y use la Rectangleherramienta para dibujar un cuadro alrededor del marcador, luego seleccione Analyze > Gels > Select First Lane(o acceso directo Ctrl+1). A continuación, arrastre el cuadro para rodear el otro carril y seleccione Analyze > Gels > Select Next Lane( Ctrl+2). Ahora seleccione Analyze > Gels > Plot Lanes( Ctrl+3) para trazar la intensidad de la imagen en función de la posición en el gel:

El área debajo de cada pico (menos el ruido de fondo) representa el total de intensidad de cada banda. Para medir esta área, use la Straightherramienta de línea ( ) para dibujar límites en la base de cada pico:

Lo he hecho un poco al azar aquí, pero entiendes la idea. Ahora, usando la herramienta de varita, haga clic dentro de cada pico e ImageJ tabulará la intensidad integrada de cada uno. A continuación se muestran las intensidades de las bandas marcadoras (siendo la banda superior la Banda 1), así como sus masas (que se conocen):

          Mass (ng)    Intensity
Band 1    45           5319.891
Band 2    28           3816.234
Band 3    24           3256.406
Band 4    16           2298.749
Band 5    15           2074.749
Band 6    8            1084.991

Tome estos datos en Excel (o similar) y grafique la intensidad en función de la masa. Parece que la banda 1 está fuera del rango lineal y está subestimando la masa. En realidad, esto era de esperar ya que, si observa detenidamente la banda en la imagen del gel, hay píxeles rojos que indican que está sobresaturada. Ignore esta banda y realice una regresión lineal en el resto.

La regresión da la ecuación$I = 134.74M + 53.988$con$R^2 = 0.9975$. Reordenando para la masa, tenemos$M = \frac{I - 53.988}{134.74}$. Obtenga la intensidad de las bandas desconocidas como se describe arriba y calcule su masa con la ecuación anterior:

          Mass (ng)    Intensity
Band 1    27           3736.991
Band 2    15           2125.284