¿Cuáles son los pros y los contras de la mutagénesis dirigida al sitio? ¿Cuáles son las alternativas?

Para un curso de laboratorio, se nos asignó "eliminar un codón de parada, usando mutagénesis, que está en el medio de un gen para que se exprese el gen completo. Luego, este emitirá fluorescencia".

Para hacer esto, estamos considerando la mutagénesis dirigida al sitio, que puede reemplazar el codón de parada, sin embargo, ¿es este un buen método? ¿Existen alternativas a SDM con Quikchange que sean mejores? ¿Cuáles son los pros y los contras del SDM que estamos pensando realizar? Para ver si lo conseguimos, utilizaremos la secuenciación del ADN y la electroforesis en gel.

Nuestro plan general se ve así:

  1. Recopilación de plásmidos de E. coli

  2. Electroforesis en gel del ADN plásmido

  3. Realiza la mutagénesis usando Quikchange
  4. Transformación por choque térmico
  5. PCR
  6. Usar un promotor lac para producir la proteína del gen

Una cuestión que se me ocurrió fue, ¿cómo nos aseguramos de que los cebadores que portan la mutación no se hibriden entre sí debido a su complementariedad?

¿Es la superposición-extensión una buena alternativa? ¿Existe alguna ventaja en el uso de mutagénesis basada en transposones o dirigida por puntos?

¡Gracias!

Si fuera mi laboratorio, pediríamos un gen sintético...
Depende... ¿se trata del proceso o del resultado?

Respuestas (2)

SDM será la herramienta perfecta para esta misión, a menos que el plásmido en cuestión sea muy grande (más de 20 kb).

Cuando haya realizado el SDM, digiera los productos con dpnI para eliminar los plásmidos originales, transforme e.coli y use un medio selectivo que coincida con su plásmido. Solo las bacterias con el plásmido podrán sobrevivir y formar colonias, recoger varias colonias y realizar una minipreparación para cada una y secuenciar el área de interés. Puede usar el resto de la minipreparación con el plásmido correcto para la transformación y la expresión. Así que sáltate el paso 5.

Aunque, como usted dice, SDM es la herramienta más adecuada, ¿son las otras formas de mutagénesis: basada en transposones y dirigida por puntos también aplicables para este laboratorio si quisiéramos? ¿Y puede pensar en alguna desventaja con el uso de SDM en este caso?

El método 'Quickchange' es probablemente lo que desea. Si le preocupa la autocomplementación (que no debería ser demasiado), puede escalonar los cebadores para que no sean completamente complementarios. solo los 10 pb deben superponerse donde está la mutación. Incluí un pequeño diagrama debajo donde la X marca la base que desea cambiar

Cebadores superpuestos

Una alternativa, que uso más que el SDM, es usar enzimas de restricción TypeIIS. ¡De esta manera puedes mutar tantas bases como quieras de una sola vez! ver este artículo

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