¿Qué sucede exactamente cuando células competentes como DH5ɑ reciben un choque térmico con ADN presente? ¿Cómo llega el ADN al interior de las células?
Específicamente, ¿por qué son necesarios todos los pasos? ¿Qué pasa si sufres un choque térmico justo después de agregar el ADN? ¿Qué pasa si no te pones hielo después del golpe de calor? ¿Qué hace el cloruro de calcio? ¿Qué sucede realmente cuando las células son "competentes"? ¿Qué gobierna la eficiencia de la transformación (además de cosas obvias como la cantidad de ADN o células)?
Para que quede claro de lo que estoy hablando, utilizo un protocolo como el siguiente:
Por lo general, obtengo miles de colonias de esto (de hecho, a menudo es necesaria una dilución de 1:10 o 1:100 para poder obtener colonias aisladas). Incluso si me salto la consecuencia, todavía obtengo cientos.
No tengo mi protocolo celular competente, pero básicamente uso ese cloruro de rubidio que todos usan: las células DH5ɑ se lavan con algunos tampones, se suspenden en una solución con CaCl2 y RbCl, luego se congelan en nitrógeno líquido. En realidad, nunca medí, pero generalmente la concentración de células en las alícuotas congeladas es aproximadamente 10 veces mayor que la que obtendría de un cultivo líquido durante la noche (se centrifugan y se resuspenden en un pequeño volumen).
La transformación del choque térmico altera la fluidez de la membrana creando poros:
Un aumento repentino de la temperatura crea poros en la membrana plasmática de las bacterias y permite que el ADN plasmídico entre en la célula bacteriana.
Referencia: Revista de Experimentos Visualizados. Transformación bacteriana: el método de choque térmico. 2014. http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method
El cambio de temperatura altera la fluidez del estado de la membrana semicristalina alcanzado a 0oC permitiendo así que la molécula de ADN entre en la célula a través de la zona de adhesión.
Referencia: Anh-Hue T. Tu. Transformación de Escherichia coli hecha competente por el protocolo de cloruro de calcio. 2008-2013. Sociedad Americana de Microbiología
... el paso de pulso de calor (0 grados C42 grados C) del procedimiento de transformación estándar había reducido considerablemente la fluidez de la membrana externa de las células. La disminución de la fluidez fue causada por la liberación de lípidos desde la superficie celular al medio extracelular. Un choque de frío posterior (42 grados C0 grados C) a las células elevó la fluidez aún más a su valor original y esto fue causado por la liberación de proteínas de membrana al medio extracelular.
Referencia: Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. ¿Cómo penetra el ADN del plásmido en las membranas celulares en el proceso de transformación artificial de Escherichia coli? mol. Miembro Biol. 2008 agosto; 25 (5): 411-22. doi: 10.1080/09687680802187765 . IDPM de PubMed: 18651316.
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