¿Por qué elegir una sola colonia bacteriana transformada?

Entonces, después de que las bacterias se hayan transformado para quizás desarrollar un plásmido de interés, ¿por qué elegir solo una colonia bacteriana de una placa selectiva para una mayor expansión?

Entiendo que esto es para garantizar que solo trabaje con una única composición genética porque cada colonia por separado se deriva de una sola bacteria. Lo que no puedo racionalizar es que si estoy tratando de expandir y aislar un plásmido de interés, todas las expansiones de colonias en una placa antibiótica selectiva deberían contener mi plásmido. Entonces, ¿es realmente necesario tomar solo una colonia, porque todas las colonias que elija deberían ser útiles para mí?

Si desea hacer varias preparaciones, elija varias colonias, pero manténgalas separadas . El objetivo de elegir una sola colonia es que es (teóricamente) un solo clon, por lo que está seguro de que su material de partida no está contaminado con otra secuencia.
Correcto, cuando hago un plásmido, normalmente tomo 24 colonias porque mi centrífuga puede contener 24 tubos. Manténgalos todos separados y etiquetados. Ha habido momentos en que solo 1 de los 24 tenía lo que quería.
¿Por qué arriesgarse a una cultura heterogénea? El flujo de trabajo pragmático siempre es mejor.

Respuestas (2)

Esta es una cuestión de pragmatismo en el proceso cultural.

Tomar 100 colonias en lugar de 1 aumenta el volumen de inoculación en un factor de 100, lo que le ahorra quizás 2 horas de tiempo de crecimiento bacteriano antes de que su cultivo alcance la OD que desea.

Sin embargo, las mutaciones y la pérdida del plásmido en el cultivo, aunque poco probables, son posibles, especialmente si las bacterias no clonaron cepas con sus recombinasas eliminadas. En tal caso, correría el riesgo de que los experimentos posteriores se contaminaran con mutantes, ya sea la expresión de proteínas, la producción de plásmidos retrovirales u otra cosa.

Peor aún, es menos probable que se detecte la mezcla de bacterias que contienen mutantes, ya que si hubiera elegido una sola colonia mutante, no habría absolutamente ningún resultado, pero un cultivo contaminado produciría un resultado bajo pero positivo. Por lo tanto, puede terminar desperdiciando muchos días o semanas resolviendo los problemas de sus experimentos posteriores.

Por lo tanto, elegir colonias individuales es simplemente una cuestión de "más vale prevenir que curar".

Si bien todas las colonias en un medio selectivo DEBERÍAN contener un gen de resistencia, está muy lejos de que contengan el plásmido que desea. Un experimento de clonación típico insertará un gen de interés en la columna vertebral de un vector vacío para hacer un plásmido intacto. La columna vertebral suele contener algún gen de resistencia a los antibióticos. Si su gen de interés no se inserta correctamente, pero el vector vacío se religa sobre sí mismo, creará una colonia viable sin su gen.

Además, he visto que ocurren mutaciones incluso cuando un inserto se inserta correctamente, y si está haciendo una ligadura de extremo romo, siempre existe el riesgo de que su inserto se inserte al revés o que se unan dos vectores.

Y todo eso tiene sentido, pero digamos, por ejemplo, que estamos cultivando un plásmido a partir de una solución madre que ya ha sido secuenciada y el gen de resistencia y el gen de interés están ambos en un solo plásmido. Ahora bien, ¿es relativamente seguro elegir cualquier número de colonias y suponer que todas tendrían el gen de interés?
Puedes probar esto fácilmente. Vuelva a suspender algunos raspados de su stock congelado en un pequeño volumen de medios y diluciones en serie de placas tanto en placas con medicamento como en placas sin medicamento. Deje crecer el mismo cultivo en un agitador durante 90 min (con el fármaco) y realice los mismos dos conjuntos de diluciones en serie. Si el stock congelado es puro, los recuentos serán los mismos más/menos fármaco. Asimismo después de crecer en líquido. Si cultivas el líquido durante el tiempo suficiente, el medicamento se agotará y es posible que comiences a ver que las células que carecen de un plásmido comienzan a acumularse.
@TheNightman Obtendrá su plásmido pero no es relativamente seguro. Si los análisis/experimentos posteriores son complejos, querrá asegurarse de comenzar con el mejor material posible. Puede extraer plásmidos con mutaciones si reúne colonias y esto podría ser muy problemático para experimentos posteriores. A veces, muy pequeños detalles hacen que un experimento tenga éxito o fracase.
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