Choque térmico vs electroporación

He estado transformando E. coli mediante choque térmico para insertar oligonucleótidos (alrededor de 50 nt); sin embargo, ninguno de mis experimentos ha dado resultados positivos hasta ahora. Comienzo a cuestionar la eficiencia de la transformación química, especialmente para fragmentos cortos de ADN. ¿Existe una diferencia tan notable entre la transformación química y la electro?

EDITAR: Estoy comprobando la expansión de la matriz CRISPR, por lo que mis oligos tienen una estructura y una longitud de protoespaciador. Estoy usando células BL21 (DE3) que tienen un T7 inducible por IPTG que primero estoy transformando con un plásmido Cas1-Cas2. Luego, induzco las células para que expresen esas proteínas, las hago competentes y luego las transformo una vez más, pero con los oligos y un plásmido eGFP (para algún tipo de selección). Para comprobar si hay resultados positivos, estoy amplificando la unión líder-repetida de la matriz CRISPR y comparo su longitud (mediante electroforesis) con una matriz habitual que no tiene integrandos.

¿Cómo haces tu transformación química? ¿Haces tú mismo las células? ¿Tienes un control positivo?
Sí, yo mismo hago que las células sean competentes. Tengo un control de plásmido para la selección de antibióticos que, por otro lado, se transforma con éxito.
En alusión a la respuesta de Damir a continuación, ¿cómo está dando resultados positivos? Un plásmido con un gen de resistencia a los antibióticos es fácil de analizar. Pero los oligos de 50 nucleótidos no llevarán un gen informador útil.
Al transformar, inserto alrededor de 30 veces más oligonucleótidos (como mol) que plásmido, suponiendo que si el plásmido ha entrado en la célula, la probabilidad de que también hayan entrado algunos oligonucleótidos es mayor. De hecho, sigue siendo bastante suerte, pero probar cientos de colonias y obtener 0 resultados me hace creer que algo anda mal. Por cierto, estoy comprobando la expansión de la matriz CRISPR, así que para probar los resultados positivos, estoy comparando la longitud del amplicón (que es la unión líder-repetida) mediante electroforesis y después de eso, haré algunas digestiones para confirmar la presencia de mis oligos.

Respuestas (1)

¿Cómo se detecta una transfección potencialmente positiva? Los fragmentos cortos pueden tener estructuras teriarias adecuadas que pueden hacer que se comporten de manera diferente a lo que cabría esperar. Además, el ADN y el ARN no circulares se degradan mucho más rápido en la mayoría de las células si faltan las señales correctas de la cabeza o la cola.

A su pregunta: la electroporación pulsada con bacterias bien preparadas (estado, tampón,...) suele ser 5-100 veces más eficiente que las bacterias químicamente competentes.

Ver mi respuesta arriba. En cuanto a la degradación de oligo (por endonucleasas por ejemplo), debo mencionar que antes de transformar, induzco la expresión de las proteínas necesarias para la etapa de adaptación CRISR.
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