¿Cómo determinar el flujo real en el modelo metabólico humano de una línea celular?

No soy un experto en la materia, pero cuantificar la expresión génica no es un problema sencillo, aunque es una posibilidad.

Una solución que sé que se puede usar es usar marcadores radiactivos. Consulte, por ejemplo, esta revisión y, en particular, la sección "El transbordador de lactato célula-célula", que podría brindar algunas ideas.

Esto puede incluir trazadores radiactivos (como [14C] lactato), trazadores no radiactivos (con [13C] o [2H]), "medidas de intercambio neto" (realmente no sé qué significa esto aquí, tal vez el tipo de cálculos de intercambio que presentan aquí ), y biopsias musculares (entonces es posible medir la concentración de metabolitos por reacción enzimática o espectrofotometría, por ejemplo).

Resumen: pruebe una de las extensiones de FBA que tienen en cuenta la regulación genética, pero tenga en cuenta las limitaciones. Consulte a continuación las referencias.

Respuesta larga:

Existen dos enfoques para estimar los flujos metabólicos internos: el (principalmente) experimental y el (principalmente) computacional. Digo principalmente, porque incluso para el enfoque experimental, es necesario realizar una gran cantidad de cálculos, y para el enfoque computacional, se deben consultar los estudios experimentales para establecer parámetros de modelo realistas.

La determinación experimental de los flujos metabólicos internos se ha centrado en el análisis de flujo metabólico de 13C (13C-MFA) realizado a través de experimentos de marcado con carbono, como se mencionó anteriormente. El 13C-MFA es complicado y costoso, por lo que existe una relativa falta de datos experimentales, y la mayoría de los experimentos cubren solo unos pocos flujos en comparación con la cantidad de reacciones posibles, generalmente varios miles en modelos metabólicos a escala del genoma. En 13C-MFA, la mayoría de los experimentos estiman los flujos en un modelo mucho más pequeño (por ejemplo, el metabolismo central del carbono), evitando o ignorando otras reacciones posibles, y el conjunto de flujos que se estiman varía entre experimentos.

Los modelos que se utilizan en enfoques computacionales para el análisis de flujo suelen ser más grandes que los modelos utilizados en los experimentos de 13C-MFA y, por lo tanto, normalmente no es posible determinar todos los flujos solo a partir de datos experimentales. Por lo tanto, se utiliza principalmente un enfoque denominado modelado basado en restricciones (COBRA). La suposición básica de la mayoría de los métodos de análisis de flujo actuales, tanto experimentales como computacionales, es que las concentraciones de metabolitos se encuentran en estado estacionario. Matemáticamente, esto se puede describir mediante la ecuación

$S\overrightarrow v = 0$

dónde$S$es una matriz estequiométrica que relaciona los metabolitos y todas las posibles reacciones (básicamente una descripción compacta del modelo metabólico), y$\overrightarrow v$es el vector de flujo que contiene todos los valores de flujo. Además del requisito de estado estacionario, normalmente se aplican restricciones a las tasas de absorción y excreción de varios metabolitos, limitándolas a valores biológicamente realistas. También se pueden aplicar otros requisitos, como los requisitos para el consumo de mantenimiento de ATP.

Debido a que normalmente hay muchos patrones de flujo posibles que obedecen a las restricciones anteriores, se necesita un principio para seleccionar una solución biológicamente realista del espacio de solución de patrones de flujo factibles. Suponiendo que las células optimizan sus patrones metabólicos de alguna manera, se utilizan diferentes funciones objetivas que intentan capturar el comportamiento metabólico de las células. Una vez que se elige una función objetivo, se puede buscar en el conjunto de posibles soluciones el patrón de flujo que da el valor objetivo más alto como una función del vector de flujo. Dado que el objetivo es lineal (simplemente una suma ponderada de flujos), se puede encontrar rápidamente una solución óptima. En general, pueden existir muchas soluciones óptimas diferentes para una función objetivo dada.El método de aplicar una función objetivo a un modelo metabólico restringido en estado estacionario se denomina análisis de balance de flujo (FBA).

El objetivo más básico y popular es la maximización de la producción de biomasa. Si bien es útil para determinar las tasas máximas de crecimiento, es poco probable que este objetivo sea realista cuando se aplica a células humanas. FBA y los métodos relacionados generalmente son adecuados para determinar los límites de rendimiento para criterios de valoración únicos, como la tasa de crecimiento o la producción de un solo metabolito, pero no son capaces de determinar con precisión todos los flujos metabólicos internos. El punto de que pueden existir muchas soluciones óptimas para una sola función objetivo es importante en este sentido.

Dado que 13C-MFA y FBA se basan en el mismo concepto de equilibrio de metabolitos, pueden verse como diferentes extremos del mismo espectro, desde puramente experimental hasta puramente computacional, con 13C-MFA restringido FBA (donde los resultados de 13C-MFA se utilizan para restringir los flujos posibles en un modelo antes de optimizar una función objetivo o minimizar la diferencia entre los flujos experimentales y la solución FBA, sujeto a restricciones adicionales) en el medio.

Para obtener una introducción al análisis de equilibrio de flujo, consulte Orth, Thiele & Palsson: "¿Qué es el análisis de equilibrio de flujo?" Naturaleza Biotecnología 28 245-48 2010.

Hay varios paquetes de software disponibles para realizar el análisis de balance de flujo. Uno de los más utilizados es COBRA Toolbox for Matlab. También se está desarrollando una versión para Python llamada CobraPy. Ambos están disponibles en http://opencobra.sourceforge.net/openCOBRA/Welcome.html

Tenga en cuenta que la mayoría de los datos de expresión génica solo muestran cambios relativos en la expresión entre dos condiciones. Por lo tanto, la mayoría de los métodos se basan en la comparación de dos condiciones diferentes. Más recientemente, la secuenciación de ARN (RNAseq) también se puede utilizar para obtener medidas más directas de los niveles de expresión génica. Se han publicado muchas extensiones y variaciones de FBA que tienen en cuenta la expresión génica. Algunos de estos son FBA regulatorio (rFBA, Covert & Palsson: Journal of Biological Chemistry, 2002 277, 28058-28064 ), Metabolic Adjustment by Differential Expression (MADE, Jensen & Papin: Bioinformatics. 2011 Feb 15;27(4):541 -7 ) e iMAT (Schlomi et al: Bioinformatics (2010) 26 (24): 3140-3142.). Para un método más reciente, gx-FBA (expresión génica-FBA), consulte *Navid & Almaas, BMC Systems Biology 2012, 6:150).

También puede leer este artículo que trata sobre la construcción de modelos metabólicos específicos de tejido: Reconstrucción computacional de modelos metabólicos específicos de tejido: aplicación al metabolismo hepático humano. Mol Syst Biol. 7 de septiembre de 2010; 6:401. doi: 10.1038/msb.2010.56.

El problema con el uso de FBA y métodos relacionados para estimar los flujos internos es que la validación de los resultados es difícil debido a la mencionada falta de datos experimentales. Escribí un informe de proyecto sobre el tema durante el último año de mi maestría, que incluye una descripción básica de 13C-MFA. Se puede leer en http://www.slideshare.net/jarlemag/rapport-31295058

No puede usar la expresión génica para estimar los flujos. Las razones son las siguientes. La expresión génica determina los niveles de ARNm que, a su vez, determinan los niveles de enzimas. Sin embargo, la relación entre la expresión génica y el nivel de enzimas no es lineal. Sin embargo, su mayor problema es que los flujos son propiedades dependientes del sistema y no dependen de ninguna enzima. Un flujo es, en principio, una función de todas las propiedades cinéticas de cada enzima en la vía. La única forma de obtener los flujos es mediante la medición directa o utilizando FBA o modelos cinéticos.