Aparentemente, es posible identificar si un inhibidor es competitivo o no competitivo a partir de gráficos de concentración de sustrato (eje x) y velocidad de reacción (eje y).
Tiene que haber una línea para con inhibidor (concentración constante) y sin inhibidor. La diferencia en y luego se puede interpretar para averiguar si el inhibidor es competitivo o no.
Sé que si el efecto del inhibidor disminuye con un aumento en la concentración de sustrato, entonces el inhibidor es competitivo.
Sin embargo, no entiendo cómo saberlo a partir de los gráficos mencionados anteriormente y y . ¿Podría alguien explicar?
He intentado buscar esto en Google, pero la mayor parte de lo que aparece son artículos académicos que están más allá de mi nivel de comprensión...
Creo que es posible identificar el tipo de inhibición a partir de las curvas de velocidad (inicial) frente a concentración de sustrato, pero es difícil. La forma habitual de hacerlo es mediante una transformación lineal de la ecuación de Michaelis-Menten, como la gráfica de Lineweaver-Burk .
Pero tiene razón: para un inhibidor reversible, la forma de identificar el patrón de inhibición (es decir, determinar si un inhibidor reversible es competitivo, no competitivo, mixto o no competitivo ) es inspeccionar los cambios en las constantes cinéticas (generalmente K m y V max , pero ver más abajo)
Antes de entrar en cómo se hace eso, hay algunos puntos que debemos tener en cuenta.
1. Patrones de inhibidores reversibles
Ahora podemos definir nuestros patrones de inhibición, independientemente de cualquier mecanismo que los origine , de la siguiente manera:
Un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre Vmax pero disminuye el valor aparente de Vmax / Km . También podemos decir, en 'términos de la vieja escuela', que un inhibidor competitivo no tiene efecto Vmax pero aumenta el valor aparente de Km . O, si vamos a 'visualizar' las cosas en términos de diagramas de Lineweaver-Burk (ver este artículo de wikipedia ), podemos decir que un inhibidor competitivo no tiene efecto en V max pero aumenta el valor aparente de K m /V max
Un inhibidor no competitivo disminuye el valor aparente de Vmax pero no tiene efecto sobre Vmax / Km . O, pensando en términos de recíprocos, un inhibidor no competitivo aumenta el valor aparente de 1/V máx pero no tiene efecto sobre K m /V máx . En muchos sentidos, 'no competitivo' es un término muy pobre. Cornish-Bowden (2004) sugiere el término 'inhibidor catalítico', y Laidler y Bunting usan el término 'anticompetitivo' para describir este tipo de inhibición.
Así que ahí lo tenemos: los dos casos que 'demarcan' la inhibición reversible son donde solo cambia la V max aparente (inhibición no competitiva) y donde solo cambia la V max /K m aparente (la constante de especificidad) (inhibición competitiva). La inhibición 'mixta' es donde los valores aparentes de ambas constantes cinéticas se ven afectados, y un caso especial de inhibición 'mixta' es donde los valores aparentes de ambas constantes cinéticas disminuyen en la misma medida, lo que resulta en ningún cambio en el Michaelis. constante.
2. Mecanismos inhibidores reversibles
Hasta ahora, no he dicho nada sobre los mecanismos que podrían dar lugar a estos patrones de inhibición. Preliminares:
(a) Inhibición Competitiva
Consideremos la inhibición reversible en una enzima de sustrato único descrita por el mecanismo que se muestra arriba, donde tanto el inhibidor como el sustrato compiten por la enzima 'libre'.
La derivación de la ley de velocidad para este mecanismo utilizando el supuesto de equilibrio o de estado estacionario conduce a una ecuación de la siguiente forma ( Segel , 1975 proporciona buenas derivaciones ):
Gráficos representativos de Eqn (1), que muestran el efecto de aumentar las concentraciones de inhibidor:
Tomando recíprocos de Eqn (1) seguido de reordenamiento conduce a la transformación lineal de Lineweaver-Burk:
Es inmediatamente obvio que el inhibidor aumenta el valor aparente de / pero no afecta 1/ .
Es decir, afecta la constante de especificidad ( / ) pero no . Por lo tanto, la inhibición es competitiva.
Los gráficos de la ecuación (2) predicen una familia de líneas rectas que se cruzan en el eje y en / , y el patrón de inhibición competitiva se reconoce fácilmente:
En términos de la transformación de Lineweaver-Burk, un inhibidor competitivo hace que la pendiente aumente pero no cambia la intersección del eje y .
También podemos ir un paso más allá. Las pendientes de las líneas anteriores vienen dadas por la siguiente ecuación:
Por lo tanto, se predice que una gráfica de pendiente frente a concentración de inhibidor será una línea recta que intersecta el eje x en -
Dichos replanteos cumplen dos funciones. En primer lugar, permiten determinar la valor. En este caso, la intercepción del eje x es -100, lo cual no es demasiado sorprendente ya que 100 era el valor de elegido en la simulación. En segundo lugar, verifican la complejidad cinética inesperada. Un gráfico de pendiente curvo, por ejemplo, podría ser indicativo de una inhibición competitiva parcial , donde el complejo de IE tal vez pueda descomponerse para dar un producto. Tal complejidad cinética es probablemente rara con enzimas de un solo sustrato, pero puede ocurrir en enzimas de múltiples sustratos (y puede requerir el rechazo de un mecanismo cinético simple como explicación de los datos cinéticos). Segel (1975) es muy fuerte en la inhibición parcial y los mecanismos que pueden dar lugar a ella. Cuando el gráfico de pendiente es lineal, podemos hablar de inhibición competitiva lineal (ver Cornish-Bowden, 2004).
Se pueden hacer varios puntos sobre la inhibición competitiva:
Finalmente, reiteremos este punto: la ecuación (1) describe un mecanismo que da lugar a un patrón de inhibición competitiva . Ciertamente no es el único.
(b) Inhibición no competitiva
Ahora consideremos un mecanismo, descrito en el diagrama anterior, donde el inhibidor no puede unirse a la enzima 'libre', sino que se une al complejo enzima-sustrato (para dar un complejo ternario EAI abortivo)
La derivación de la ley de velocidad de su mecanismo (nuevamente al hacer el supuesto de estado estacionario o de equilibrio; ver Segel, 1975) conduce a una ecuación de la siguiente forma:
Transformación a la forma de Lineweaver-Burk :
En este caso, el inhibidor aumenta el valor aparente de 1/ pero no hace efecto /
En otras palabras, afecta el valor aparente de , pero no tiene efecto sobre la constante de especificidad ( / ). Por lo tanto, la inhibición no es competitiva .
Además, a diferencia del caso de la inhibición competitiva, el aumento de la concentración de sustrato no elimina la inhibición.
Un inhibidor no competitivo hace que aumente la pendiente de un gráfico de Lineweaver-Burk, pero no cambia la intersección del eje y de dicho gráfico .
Por lo tanto, parcelas doblemente recíprocas de / contra / en diferentes forman una familia de rectas paralelas .
En este caso, el puede determinarse a partir de una intercepción-representación, donde la intersección del eje x es - .
(c) Inhibición mixta
Ahora, consideremos un mecanismo en el que el inhibidor puede unirse a la enzima 'libre' o al complejo enzima-sustrato y (para mantener las cosas algo realistas) en el que el sustrato puede unirse a la enzima libre o al complejo enzima-inhibidor.
Bajo ciertos supuestos simplificadores (ver Segel, 1975), el mecanismo que se muestra arriba puede dar lugar a la siguiente ley de velocidad:
En este caso, hay dos constantes de inhibición, una que 'rige' la unión del inhibidor a la enzima 'libre' ( ) y uno que 'rige' la unión del inhibidor al complejo enzima-sustrato ( ).
Tomando recíprocos, la correspondiente transformación de Lineweaver-Burk se puede expresar de la siguiente manera:
El inhibidor aumenta tanto el valor aparente de 1/ y (no necesariamente el mismo factor) y el valor aparente de / . Por lo tanto, la inhibición es mixta .
La ecuación (7) predice una familia de líneas rectas que se cortan en un solo punto:
En este caso, los gráficos de pendiente e intercepción se pueden usar para determinar los valores de y . Se da un análisis detallado de tales parcelas en Segel (1975).
(d) Inhibición no competitiva
Llegamos ahora al caso de la inhibición no competitiva, que (como se indicó anteriormente) es mejor considerarlo como un caso especial de inhibición mixta. Cuando = , la ecuación (6) se simplifica a lo siguiente:
La transformación de Lineweaver-Burk :
La ecuación (10) predice una familia de líneas donde el aumento afecta tanto a la pendiente como al intercepto en la misma medida, y que se intersecan en el eje x en /
Pero ¿por qué debería igual en cualquier caso realista?
notas
Fersht ahora posee los derechos de autor de su libro y lo distribuye de forma gratuita.
Todos los números de Acta Chem Scand (1947 - 1999), incluidos muchos artículos clásicos, están disponibles en línea.
En esta respuesta de Biology Stack Exchange se proporciona un ejemplo de una derivación de la ley de tasa de estado estacionario
Referencias
Cook, PF y Cleland , WW (2007). Cinética y mecanismo de enzimas. Publicación científica Garland (Taylor & Francis Group). Londres y Nueva York.
Cornish-Bowden , A. (2004). Fundamentos de la Cinética Enzimática. 3ra ed. Portland Press Ltd, Londres.
Dalziel, K. (1957). Velocidades iniciales en estado estacionario en la evaluación de mecanismos de reacción enzima-coenzima-sustrato. Acta Chem. Escanear. 11, 1706 - 1723. [ pdf ]
Dalziel, K. (1975). Cinética y mecanismo de las deshidrogenasas unidas a nucleótidos de nicotinamida. En The Enzymes, 3ª ed., vol. 11. Boyer, PD, Ed. pp 1 - 60. Academic Press, Nueva York.
Fersht, A. (1999). Estructura y mecanismo en la ciencia de las proteínas. Una guía para la catálisis enzimática y el plegamiento de proteínas. WH Freeman, Nueva York. [ pdf ]
Li, T. - K. y Theorell, H. (1969). Alcohol deshidrogenasa hepática humana: inhibición por pirazol y análogos de pirazol. Acta Chem. Escanear. 23, 892 - 902. [ pdf ]
Lineweaver, H. y Burk, D. (1934). La determinación de las constantes de disociación enzimática. Mermelada. química Soc . 56, 658 - 666.
Segel , IH (1975). La cinética de enzimas. Comportamiento y Análisis de Sistemas Enzimáticos de Equilibrio Rápido y Estado Estacionario. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York.
El inhibidor competitivo compite por el sitio activo. Por lo tanto, interferirá con la unión del sustrato aumentando así la KM aparente .
Un inhibidor estrictamente no competitivo no compite por el sitio activo. Sin embargo, inhibe la catálisis reduciendo las moléculas disponibles de enzima activa, E0 ( si es un inhibidor perfecto), reduciendo así la Vmax .
También puede haber inhibidores mixtos y puede haber diferentes tipos de inhibición mixta. Por ejemplo, un inhibidor que interfiere con la catálisis y también puede competir por el sitio activo.
Dependiendo de cómo defina K M , un inhibidor no competitivo puede o no cambiarlo. Si dicho inhibidor puede unirse a la enzima en el sitio no activo y reducir su k cat , cambia la KM así como la V max en el caso de la cinética de Briggs-Haldane .
David
mirte