Identificación del tipo de inhibidor de KmKmK_m y VmaxVmaxV_{max}

Creo que es posible identificar el tipo de inhibición a partir de las curvas de velocidad (inicial) frente a concentración de sustrato, pero es difícil. La forma habitual de hacerlo es mediante una transformación lineal de la ecuación de Michaelis-Menten, como la gráfica de Lineweaver-Burk .

Pero tiene razón: para un inhibidor reversible, la forma de identificar el patrón de inhibición (es decir, determinar si un inhibidor reversible es competitivo, no competitivo, mixto o no competitivo ) es inspeccionar los cambios en las constantes cinéticas (generalmente K _m y V _max , pero ver más abajo)

Antes de entrar en cómo se hace eso, hay algunos puntos que debemos tener en cuenta.

• Lo siguiente solo se aplica a los inhibidores reversibles . La inhibición irreversible, como la inhibición de la acetilcolinesterasa por el gas nervioso sarín , se trata de manera diferente . (Por 'reversible', simplemente se quiere decir que si se elimina el inhibidor, por dilución, por ejemplo, la inhibición desaparece). Además, no se consideran los inhibidores de unión fuerte .
• Lo siguiente también se aplica solo a las enzimas de sustrato único que obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. (Pero el análisis puede extenderse, sin demasiada dificultad, a enzimas multisustrato).
• Tenemos que tener mucho cuidado con el término 'no competitivo'. Significa diferentes cosas para diferentes personas. También suele ser el patrón de inhibición menos interesante .
• Cuando se analizan los patrones de inhibición, a menudo es más fácil analizar el efecto sobre Vmax _y Vmax _/ Km ₍ la constante de especificidad), que sobre _Km y _Vmax . La razón de esto es que Km es una constante cinética compleja y (como han demostrado Dalziel y Fersht ), debe considerarse como la relación entre V _max y la constante de especificidad (V _max /K _m ). A este respecto, los cinéticos enzimáticos han 'estropeado las cosas' al considerar que la constante de especificidad es la relación entre la velocidad máxima y la constante de Michaelis:es la constante de Michaelis la que es la razón . Sin embargo, el paradigma de considerar la constante de especificidad como V _max /K _m ahora está tan arraigado que lo mantendré. Pero el 'truco' al analizar los patrones de inhibición es pensar en términos de _Vmax y _Vmax / _Km .
• Gran parte de lo que sigue también puede aplicarse a la activación reversible, pero no voy a entrar en eso en absoluto.

1. Patrones de inhibidores reversibles

Ahora podemos definir nuestros patrones de inhibición, independientemente de cualquier mecanismo que los origine , de la siguiente manera:

• Un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre Vmax _pero disminuye el valor aparente de _Vmax / _Km . También podemos decir, en 'términos de la vieja escuela', que un inhibidor competitivo no tiene efecto Vmax _pero aumenta el valor aparente de _Km . O, si vamos a 'visualizar' las cosas en términos de diagramas de Lineweaver-Burk (ver este artículo de wikipedia ), podemos decir que un inhibidor competitivo no tiene efecto en V _max pero aumenta el valor aparente de K _m /V _max

• Un inhibidor no competitivo disminuye el valor aparente de Vmax _pero no tiene efecto sobre _Vmax / _Km . O, pensando en términos de recíprocos, un inhibidor no competitivo aumenta el valor aparente de 1/V _máx pero no tiene efecto sobre K _m /V _máx . En muchos sentidos, 'no competitivo' es un término muy pobre. Cornish-Bowden (2004) sugiere el término 'inhibidor catalítico', y Laidler y Bunting usan el término 'anticompetitivo' para describir este tipo de inhibición.

• Un inhibidor mixto disminuye el valor aparente de Vmax _y disminuye el valor aparente de _Vmax / _Km . O, pensando en términos de recíprocos, un inhibidor 'mixto' aumenta el valor aparente de 1/V _máx . y aumenta el valor aparente de K _m /V _máx .
• Un inhibidor no competitivo se considera mejor como un caso especial de inhibición mixta en el que los valores aparentes de Vmax _y Vmax _/ Km _disminuyen en la misma medida . Hay una consecuencia interesante de esto: como la constante de Michaelis puede considerarse como la relación de estas dos constantes cinéticas, no cambia en la inhibición no competitiva . Pero es difícil imaginar un mecanismo cinético realista que resulte en este tipo de comportamiento. Cornish-Bowden (2004, pp 118-119) es muy fuerte en este punto (también hay una cuarta edición de este gran libro).
• Ahora llegamos a un poco 'complicado'. Algunas autoridades, en particular Cleland , no distinguen entre inhibición "mixta" y "no competitiva" , sino que denominan "inhibición no competitiva" a todos los casos en los que tanto _Vmax como _Vmax / _Km disminuyen . Tenemos que tener mucho cuidado con esto. Como alguien dijo una vez, los cinéticos de enzimas preferirían usar los cepillos de dientes de los demás en lugar de usar la nomenclatura de los demás.

Así que ahí lo tenemos: los dos casos que 'demarcan' la inhibición reversible son donde solo cambia la V _max aparente (inhibición no competitiva) y donde solo cambia la V _max /K _{m aparente (la constante de especificidad) (inhibición competitiva).} La inhibición 'mixta' es donde los valores aparentes de ambas constantes cinéticas se ven afectados, y un caso especial de inhibición 'mixta' es donde los valores aparentes de ambas constantes cinéticas disminuyen en la misma medida, lo que resulta en ningún cambio en el Michaelis. constante.

2. Mecanismos inhibidores reversibles

Hasta ahora, no he dicho nada sobre los mecanismos que podrían dar lugar a estos patrones de inhibición. Preliminares:

• En lo que sigue,$K_m$es la constante de Michaelis,$V_{max}$es la velocidad máxima,$s$es la concentración de sustrato,$i$es la concentración de inhibidor, y$K_{i}$y$K_{ii}$son constantes de inhibición. Ambas cosas$v$y$v_i$referirse a la velocidad inicial.
• Los patrones de inhibición se analizan utilizando el diagrama de Lineweaver-Burk . Esto es conveniente ya que en tal gráfico (ver este artículo de wikipedia), la intersección del eje y es igual a$1$/$V_{max}$y la pendiente es igual$K_m$/$V_{max}$. Los cambios en el valor aparente de$V_{max}$se manifiestan como un efecto de intersección con el eje y, y los cambios en la constante de especificidad ($V_{max}$/$K_m$) se manifiestan como un efecto de pendiente. Además, la intersección del eje x es igual a$-1$/$K_m$, por lo que los cambios en el aparente$K_m$el valor, o la falta de tal cambio, se reconoce fácilmente.
• La gráfica de Lineweaver-Burk no es la única transformación lineal de la ecuación de Michelis-Menten, ni siquiera la mejor (ver aquí ). Otros gráficos son el gráfico de Hanes-Woolf y el gráfico de Eadie-Hofstee . Como alguien dijo una vez, los bioquímicos adoran el altar de la línea recta. Uso el diagrama de Lineweaver-Burk porque, al menos en mi opinión, es el más intuitivo.
• Debe tenerse en cuenta que muchos mecanismos cinéticos pueden dar lugar a un patrón de inhibición. Muchos mecanismos cinéticos pueden dar lugar a una inhibición competitiva, por ejemplo. Lo que sigue son ejemplos ilustrativos.
• Todos los diagramas a continuación (generados usando Mathematica ) fueron creados con$V_{max}$= 100 y$K_m$= 10. Cuando solo se requería una constante de inhibición ($K_i$), se fijó en 100. Cuando se requerían dos, el segundo ($K_{ii}$) se fijó en 20 (Todas las 'unidades arbitrarias'). Los gráficos, por supuesto, son muy fáciles de generar y se pueden hacer con muchas aplicaciones de software.

(a) Inhibición Competitiva

Consideremos la inhibición reversible en una enzima de sustrato único descrita por el mecanismo que se muestra arriba, donde tanto el inhibidor como el sustrato compiten por la enzima 'libre'.

La derivación de la ley de velocidad para este mecanismo utilizando el supuesto de equilibrio o de estado estacionario conduce a una ecuación de la siguiente forma ( Segel , 1975 proporciona buenas derivaciones ):

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}(1 + {i\over{K_{i}}})} + s}\ \ \ \ \ (1)$$

Gráficos representativos de Eqn (1), que muestran el efecto de aumentar las concentraciones de inhibidor:

Tomando recíprocos de Eqn (1) seguido de reordenamiento conduce a la transformación lineal de Lineweaver-Burk:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}\ \ \ \ \ (2)$$

Es inmediatamente obvio que el inhibidor aumenta el valor aparente de$K_{m}$/$V_{max}$pero no afecta 1/$V_{max}$.

Es decir, afecta la constante de especificidad ($V_{max}$/$K_{m}$) pero no$V_{max}$. Por lo tanto, la inhibición es competitiva.

Los gráficos de la ecuación (2) predicen una familia de líneas rectas que se cruzan en el eje y en$1$/$V_{max}$, y el patrón de inhibición competitiva se reconoce fácilmente:

En términos de la transformación de Lineweaver-Burk, un inhibidor competitivo hace que la pendiente aumente pero no cambia la intersección del eje y .

También podemos ir un paso más allá. Las pendientes de las líneas anteriores vienen dadas por la siguiente ecuación:

$$slope = \frac{K_m}{V_{max}} + \frac{K_m}{V_{max} K_{i}}{i}\ \ \ \ \ (3)$$

Por lo tanto, se predice que una gráfica de pendiente frente a concentración de inhibidor será una línea recta que intersecta el eje x en -$K_i$

Dichos replanteos cumplen dos funciones. En primer lugar, permiten determinar la$K_{i}$valor. En este caso, la intercepción del eje x es -100, lo cual no es demasiado sorprendente ya que 100 era el valor de$K_i$elegido en la simulación. En segundo lugar, verifican la complejidad cinética inesperada. Un gráfico de pendiente curvo, por ejemplo, podría ser indicativo de una inhibición competitiva parcial , donde el complejo de IE tal vez pueda descomponerse para dar un producto. Tal complejidad cinética es probablemente rara con enzimas de un solo sustrato, pero puede ocurrir en enzimas de múltiples sustratos (y puede requerir el rechazo de un mecanismo cinético simple como explicación de los datos cinéticos). Segel (1975) es muy fuerte en la inhibición parcial y los mecanismos que pueden dar lugar a ella. Cuando el gráfico de pendiente es lineal, podemos hablar de inhibición competitiva lineal (ver Cornish-Bowden, 2004).

Se pueden hacer varios puntos sobre la inhibición competitiva:

• Uno de los "sellos distintivos" de la inhibición competitiva es que el efecto inhibidor puede superarse agregando un exceso de sustrato.
• Un inhibidor competitivo no necesita unirse al sitio activo. Todo lo que se requiere es que se una a la enzima libre de una manera que impida la unión al sustrato . Un inhibidor alostérico , por ejemplo, puede ser competitivo. Pero, por supuesto, la competencia entre el sustrato y el inhibidor por el mismo sitio activo es una forma en que puede surgir la inhibición competitiva (suponiendo que la unión del inhibidor impide la unión del sustrato). Segel (1975) es muy fuerte en este punto.
• Un buen ejemplo de un inhibidor competitivo es el ácido malónico, que inhibe la succinato deshidrogenasa (ver Segel, 1975). En el mundo de la cinética de dos sustratos, el pirazol es un inhibidor competitivo, con respecto al etanol, de la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo, y un artículo clásico (Li y Theorell) que demuestra esto está disponible aquí

Finalmente, reiteremos este punto: la ecuación (1) describe un mecanismo que da lugar a un patrón de inhibición competitiva . Ciertamente no es el único.

(b) Inhibición no competitiva

Ahora consideremos un mecanismo, descrito en el diagrama anterior, donde el inhibidor no puede unirse a la enzima 'libre', sino que se une al complejo enzima-sustrato (para dar un complejo ternario EAI abortivo)

La derivación de la ley de velocidad de su mecanismo (nuevamente al hacer el supuesto de estado estacionario o de equilibrio; ver Segel, 1975) conduce a una ecuación de la siguiente forma:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}} + (1 + {i\over{K_{i}}}) s}\ \ \ \ \ (3)$$

Transformación a la forma de Lineweaver-Burk :

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_i}})\ \ \ \ \ (4)$$

En este caso, el inhibidor aumenta el valor aparente de 1/$V_{max}$pero no hace efecto$K_{m}$/$V_{max}$

En otras palabras, afecta el valor aparente de$V_{max}$, pero no tiene efecto sobre la constante de especificidad ($V_{max}$/$K_{m}$). Por lo tanto, la inhibición no es competitiva .

Además, a diferencia del caso de la inhibición competitiva, el aumento de la concentración de sustrato no elimina la inhibición.

Un inhibidor no competitivo hace que aumente la pendiente de un gráfico de Lineweaver-Burk, pero no cambia la intersección del eje y de dicho gráfico .

Por lo tanto, parcelas doblemente recíprocas de$1$/$v_i$ contra $1$/$s$en diferentes$i$forman una familia de rectas paralelas .

En este caso, el$K_{i}$puede determinarse a partir de una intercepción-representación, donde la intersección del eje x es -$K_i$.

$$intercept={1\over{V_{max}}} +{i\over{V_{max} {K_i}}}\ \ \ \ \ (5)$$

(c) Inhibición mixta

Ahora, consideremos un mecanismo en el que el inhibidor puede unirse a la enzima 'libre' o al complejo enzima-sustrato y (para mantener las cosas algo realistas) en el que el sustrato puede unirse a la enzima libre o al complejo enzima-inhibidor.

Bajo ciertos supuestos simplificadores (ver Segel, 1975), el mecanismo que se muestra arriba puede dar lugar a la siguiente ley de velocidad:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}(1 + {i\over{K_{i}}})} + (1 + {i\over{K_{ii}}}) s}\ \ \ \ \ (6)$$

En este caso, hay dos constantes de inhibición, una que 'rige' la unión del inhibidor a la enzima 'libre' ($K_{i}$) y uno que 'rige' la unión del inhibidor al complejo enzima-sustrato ($K{ii}$).

Tomando recíprocos, la correspondiente transformación de Lineweaver-Burk se puede expresar de la siguiente manera:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_{ii}}})\ \ \ \ \ (7)$$

El inhibidor aumenta tanto el valor aparente de 1/$V_{max}$y (no necesariamente el mismo factor) y el valor aparente de$K_{m}$/$V_{max}$. Por lo tanto, la inhibición es mixta .

La ecuación (7) predice una familia de líneas rectas que se cortan en un solo punto:

$$({x, y})= (-\frac{K_{ii}}{K_i K_m}, \frac{K_{i} - K_{ii}}{K_i V_{max}}) = (-0.02,0.008) \ \ \ \ \ (8)$$

En este caso, los gráficos de pendiente e intercepción se pueden usar para determinar los valores de$K_i$y$K_{ii}$. Se da un análisis detallado de tales parcelas en Segel (1975).

(d) Inhibición no competitiva

Llegamos ahora al caso de la inhibición no competitiva, que (como se indicó anteriormente) es mejor considerarlo como un caso especial de inhibición mixta. Cuando$K_i$=$K_{ii}$, la ecuación (6) se simplifica a lo siguiente:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over(1 + {i\over{K_{i}}})(K_{m} +s)}\ \ \ \ \ (9)$$

La transformación de Lineweaver-Burk :

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_{i}}})\ \ \ \ \ (10)$$

La ecuación (10) predice una familia de líneas donde el aumento$i$afecta tanto a la pendiente como al intercepto en la misma medida, y que se intersecan en el eje x en$-1$/$K_m$

Pero ¿por qué debería$K_i$igual$K_{ii}$en cualquier caso realista?

notas

Fersht ahora posee los derechos de autor de su libro y lo distribuye de forma gratuita.

Todos los números de Acta Chem Scand (1947 - 1999), incluidos muchos artículos clásicos, están disponibles en línea.

En esta respuesta de Biology Stack Exchange se proporciona un ejemplo de una derivación de la ley de tasa de estado estacionario

Referencias

Cook, PF y Cleland , WW (2007). Cinética y mecanismo de enzimas. Publicación científica Garland (Taylor & Francis Group). Londres y Nueva York.

Cornish-Bowden , A. (2004). Fundamentos de la Cinética Enzimática. 3ra ed. Portland Press Ltd, Londres.

Dalziel, K. (1957). Velocidades iniciales en estado estacionario en la evaluación de mecanismos de reacción enzima-coenzima-sustrato. Acta Chem. Escanear. 11, 1706 - 1723. [ pdf ]

Dalziel, K. (1975). Cinética y mecanismo de las deshidrogenasas unidas a nucleótidos de nicotinamida. En The Enzymes, 3ª ed., vol. 11. Boyer, PD, Ed. pp 1 - 60. Academic Press, Nueva York.

Fersht, A. (1999). Estructura y mecanismo en la ciencia de las proteínas. Una guía para la catálisis enzimática y el plegamiento de proteínas. WH Freeman, Nueva York. [ pdf ]

Li, T. - K. y Theorell, H. (1969). Alcohol deshidrogenasa hepática humana: inhibición por pirazol y análogos de pirazol. Acta Chem. Escanear. 23, 892 - 902. [ pdf ]

Lineweaver, H. y Burk, D. (1934). La determinación de las constantes de disociación enzimática. Mermelada. química Soc . 56, 658 - 666.

Segel , IH (1975). La cinética de enzimas. Comportamiento y Análisis de Sistemas Enzimáticos de Equilibrio Rápido y Estado Estacionario. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York.

El inhibidor competitivo compite por el sitio activo. Por lo tanto, interferirá con la unión del sustrato aumentando así la KM _aparente .

Un inhibidor estrictamente no competitivo no compite por el sitio activo. Sin embargo, inhibe la catálisis reduciendo las moléculas disponibles de enzima activa, E0 ₍ si es un inhibidor perfecto), reduciendo así la _Vmax .

También puede haber inhibidores mixtos y puede haber diferentes tipos de inhibición mixta. Por ejemplo, un inhibidor que interfiere con la catálisis y también puede competir por el sitio activo.

Dependiendo de cómo defina K _M , un inhibidor no competitivo puede o no cambiarlo. Si dicho inhibidor puede unirse a la enzima en el sitio no activo y reducir su k _cat , cambia la KM _así como la V _max en el caso de la cinética de Briggs-Haldane .