Unión de cationes divalentes a calmodulina

He realizado una PAGE nativa con 4 mezclas de reacción. A cada uno se le había añadido un volumen igual de EDTA (1 µl/1 mM) para secuestrar los iones divalentes y un volumen igual de calmodulina (5 µl/0,5 mg/ml). Agregué 2 µl de iones de calcio (2 mM), magnesio (2 mM) y manganeso (2 mM) respectivamente a tres mezclas de reacción y obtuve un control que se completó hasta un volumen igual con Tris-HCl. Todas las mezclas de reacción se completaron hasta 10 µl con Tris-HCl. Aquí me encontré con un problema con los baños de agua y las reacciones no se podían incubar a 37 grados centígrados.

Después de agregar el tampón de carga a cada uno, agregué las 4 mezclas de reacción al gel de poliacrilamida y sometí a electroforesis durante 45 minutos a 150 V. Después de esto, coloqué el gel en tinción azul de Coomassie durante 20 minutos.

Después del proceso de decoloración, revisé el gel para encontrar que la calmodulina en los 4 carriles había migrado la misma distancia. Esperaba que el control de EDTA hubiera migrado más lejos en el gel, con Ca2+ y Mn2+ migrando distancias similares debido a sus radios iónicos similares; por lo que es un buen sustituto de la unión a la calmodulina. No estaba seguro de qué tan lejos viajaría el Mg2+, ya que pensé que tendría una menor afinidad con la calmodulina debido a su unión al extremo N-terminal en lugar del extremo C-terminal. Sin embargo, me preguntaba si esto era insignificante en ausencia de Ca2+, aunque ahora no puedo estar seguro debido a los resultados del gel.

Me preguntaba qué errores en el diseño o proceso experimental podrían haber resultado en esto. Y si el experimento se ejecutó correctamente, ¿qué resultados se esperarían?

La primera imagen es el resultado que esperaba. El segundo son los resultados de mi electroforesis en gel.